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背景:缺血性心脏病是一类严重危害人类健康的疾病,尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)发生后,心肌细胞数量减少,梗死区纤维组织增生,逐渐发生退行性左心室重塑,心功能下降,最终导致心力衰竭。尽管目前的药物治疗、介入治疗及冠脉旁路手术能够改善心肌缺血,但仍然不能逆转已经坏死的心肌,更不能促进心肌细胞的再生。近年来,随着干细胞学与组织工程学的发展,干细胞移植已成为缺血性心脏病治疗的一条新途径。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)具有分化为心肌细胞、内皮细胞的多向分化潜能,且分离方便、增殖容易、遗传稳定、无免疫排斥和伦理障碍等优势,被认为是细胞移植治疗缺血性心脏病的理想供体细胞。然而,MSCs移植至梗塞心脏后的低存活率严重制约了细胞移植的疗效。大量研究表明,心肌缺血微环境诱导的MSCs凋亡被认为是导致供体细胞低存活率的主要因素。因此,探讨心肌缺血微环境诱导MSCs凋亡的机制及寻求一种有效的抗MSCs凋亡的方法有着十分重要的理论意义和应用价值。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是继一氧化氮(Nitric Oxide,NO)和一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)之后新发现的一种气体信号分子,具有广泛的生物学效应,在心血管、神经、消化等系统均可发挥重要的调节功能。在哺乳动物体内,内源性H2S是机体多种细胞以半胱氨酸为底物,主要在胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)催化作用下产生。H2S的重要生物学功能是调节细胞凋亡。有研究报道,H2S参与了血管平滑肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、胰腺腺泡细胞等细胞凋亡的调控,在神经、消化、呼吸、内分泌系统,H2S主要表现为抑制细胞凋亡;在心血管系统,H2S对细胞凋亡的调控较复杂,例如,生理浓度的H2S可抑制心肌细胞、血管内皮细胞的凋亡,但可诱导血管平滑肌细胞凋亡。最近研究发现外源性H2S预处理能显著抑制缺氧/无血清(Hypoxia and Serum Deprivation,H/SD)诱导的MSCs凋亡及移植大鼠急性心肌梗塞模型能减少心肌梗塞面积,促进血管生成,改善心功能。但内源性H2S在MSCs中是否存在及其对MSCs移植后受缺氧微环境诱导的供体细胞凋亡是否具有调节作用?迄今未见有文献报道。目的:内源性H2S作为一个新的气体信号分子,参与了多个系统生理功能的调节及疾病病程,本课题的目的是探讨内源性H2S在缺氧/无血清诱导MSCs凋亡中的作用及其机制。方法:(1)体外分离培养、扩增SD大鼠MSCs,采用Western blot方法检测MSCs内源性H2S合成酶CBS和CSE的表达;(2)体外建立缺氧/无血清诱导MSCs凋亡模型,采用流式细胞仪、亚甲基蓝分光光度计法、Western blot检测缺氧/无血清对MSCs内源性H2S水平及其合成酶CSE蛋白表达、活性的影响及与MSCs凋亡的相关性;(3)构建含大鼠CSE基因的慢病毒表达载体,转染MSCs,上调CSE表达,同时应用CSE抑制剂PAG抑制CSE表达,采用Western blot、流式细胞仪、亚甲基蓝分光光度计法检测内源性H2S的改变对缺氧/无血清诱导MSCs凋亡及内源性H2S水平的影响。(4)构建含SD大鼠CSE基因的慢病毒表达载体,转染MSCs,上调CSE表达,采用Western blot检测CSE过表达对缺氧/无血清诱导MSCs凋亡相关蛋白Cyt c、Bcl-2、Bax、GRP78、CHOP及P13K/Akt通路的影响。结果:(1)MSCs内存在H2S合成酶CSE蛋白表达而无CBS蛋白表达;MSCs在加入底物L-半胱氨酸后能够产生内源性H2S,CSE抑制剂PAG显著抑制了MSCs内源性H2S生成,而CBS抑制剂AOAA对MSCs内源性H2S生成没有影响。(2)缺氧/无血清可呈时间依赖性诱导MSCs凋亡及减少内源性H2S生成;与正常对照组相比,随着缺氧/无血清时间的延长,CSE蛋白表达及活性显著降低。(3)成功构建SD大鼠CSE基因的慢病毒表达载体p LV-Zs Green-CSE lentivirus及空载体p LV-Zs Green lentivus并感染MCSs(分别记为CSEMSCs组、GFPMSCs组),Western blot显示,与正常对照组(NormMSCs)及GFPMSCs相比,CSEMSCs组CSE蛋白表达显著增高(大于2.4倍),上述结果表明CSE基因过表达骨髓间充质干细胞系建立成功。进一步采用Western blot分析CSE过表达对缺氧/无血清诱导MSCs凋亡及内源性H2S生成的影响,结果显示:与GFPMSCs及NormMSCs相比,在H/SD12h状态下,CSEMSCs组凋亡率显著降低,另外,CSEMSCs组内源性H2S含量显著高于GFPMSCs及NormMSCs组;而CSE抑制剂PAG(5 mmol/l)明显促进了MSCs凋亡,同时显著抑制了内源性H2S的产生,单纯PAG对MSCs凋亡没有影响。(4)Western blot结果显示,在H/SD12h状态下,CSEMSCs组线粒体Cyt c[Cyt c(mito)]蛋白表达水平显著高于GFPMSCs组及NormMSCs组,而CSEMSCs组胞浆Cyt c[Cyt c(cyto)]蛋白表达水平显著低于GFPMSCs组及NormMSCs组;同时,我们发现CSEMSCs组Bcl-2、Bax、GRP78、CHOP蛋白表达水平显著高于GFPMSCs组及NormMSCs组;与GFPMSCs组及NormMSCs组相比,CSE过表达(CSEMSCs组)则显著诱导了Akt磷酸化,而CSE抑制剂PAG(5 mmol/l)显著抑制了CSE过表达诱导的Akt磷酸化。结论:(1)MSCs存在内源性H2S及其合成酶CSE蛋白的表达;(2)内源性H2S参与了缺氧/无血清诱导MSCs凋亡的调节作用;(3)内源性H2S可能通过线粒体、内质网应激凋亡途径及PI3K/Akt通路参与缺氧/无血清诱导MSCs凋亡的调节作用。