人工合成孕激素的消耗量远远大于雌激素或雄激素,近二十年来其在环境研究中备受关注。许多孕激素影响鱼类的性别分化及繁殖,包括影响配子生成、产卵、性别分化和激素水平。去氢孕酮(dydrogesterone,DDG)是一种人工合成孕激素,广泛应用于妇产科疾病,包括激素替代治疗和复发性流产等。去氢孕酮是许多国家最常用的合成孕激素之一,在各种水环境中均有发现。最近的研究表明,环境中的去氢孕酮可能对鱼类产生内分泌干扰效应,它能增加斑马鱼的排卵后卵泡和闭锁卵泡的比率、促进卵子和精子生成、造成雄性偏多的性别比例和扰乱昼夜节律。因此去氢孕酮具有生态危害风险。已有多项研究证实去氢孕酮对斑马鱼有不良影响,大多数研究是基于组织学和转录组学方法,但是其对鱼类代谢的影响的数据还很匮乏。代谢物是细胞生理过程的最终产物,其变化可视为生物对遗传或环境变化的最终反应。代谢组学是对生物样品中所有代谢物进行综合分析的方法,已成为研究毒理机制的有效手段。因此,通过代谢组学方法研究去氢孕酮引起的代谢物变化及其相关通路是有意义的。本研究的目的是利用代谢组学、组织学和傅里叶变换红外光谱(FTIR)等方法探讨去氢孕酮影响斑马鱼的毒理效应。我们将斑马鱼胚胎分别暴露于0(C)、2.8(L)、27.6(M)和289.8(H)ng/L的去氢孕酮中。在暴露的第35天取部分幼年斑马鱼(35 dpf)进行代谢组学和红外光谱分析。其余斑马鱼仍暴露于去氢孕酮中直至性成熟(共140天),然后分析暴露组和对照组斑马鱼的性腺、脑部和肝脏的代谢组学、组织学和FTIR变化。并结合本研究的结果和前人的相关研究结果分析去氢孕酮干扰斑马鱼生理功能的机理。所取得的主要进展包括:(1)去氢孕酮影响斑马鱼幼鱼的生理状态并以剂量依赖的方式增加雄性斑马鱼的百分比。红外光谱分析结果表明去氢孕酮导致35 dpf的斑马鱼幼鱼体内脂质和蛋白质的积累。幼鱼的代谢组学分析结果表明去氢孕酮使部分游离脂肪酸(特别是n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs))、甘油单酯、酰基肉碱和有机酸水平升高,而溶血磷脂、尿酸和胆汁酸水平下降。去氢孕酮暴露也降低了单磷酸核苷和UDP-糖的含量,而增加了核苷及其碱基的含量。这些代谢物变化可能抑制了NF-κB/COX-2和Wnt/β-catenin通路,或激活了p53通路,从而导致斑马鱼幼鱼卵母细胞凋亡并开启卵巢向精巢的转化,最终导致更多斑马鱼发育为雄鱼。(2)去氢孕酮影响了斑马鱼性腺的生理状态和生殖功能。组织学切片结果显示,暴露140天后,去氢孕酮促进了成年斑马鱼性腺中卵子发生和精子发生。去氢孕酮导致雌鱼卵巢内的排卵后卵泡和闭锁卵泡增加。精巢红外光谱结果显示脂质的减少和DNA的增加。卵巢红外光谱结果显示蛋白质的积累。卵巢代谢组学结果显示,去氢孕酮增加了由蛋白质和脂质等大分子分解代谢形成的游离氨基酸、尿素、腐胺、游离脂肪酸、酰基肉碱和溶血磷脂等代谢物的浓度。去氢孕酮可能通过某些代谢物诱导卵母细胞成熟、排卵和卵母细胞过熟。花生四烯酸能诱导卵母细胞成熟,而5-oxo-6,8,11-eicosatetraenoic acid(5-oxo-ETE)及嘌呤能信号通路的代谢物能促进排卵。然而,前列腺素PGF2α含量下降可能会抑制产卵和受损卵泡组织降解,这解释了卵母细胞过熟的出现和闭锁卵泡的增加。(3)去氢孕酮影响了斑马鱼脑部的生理状态和昼夜节律功能。红外光谱的结果显示暴露组斑马鱼脑部核酸和碳水化合物含量的减少以及蛋白质二级结构的变化。暴露组雌鱼还出现脂质积累。代谢组学结果显示,暴露组斑马鱼脑中胆固醇、饱和脂肪酸和单磷酸核苷的含量均增加,而多不饱和脂肪酸、溶血磷脂和核苷的含量则降低。本研究中去氢孕酮引起的代谢物变化与我们前期研究中去氢孕酮引起的生物钟基因变化有明显的相关性。因此,去氢孕酮处理组斑马鱼脑部的代谢谱可能是昼夜节律紊乱的反映,某些代谢物如饱和脂肪酸、胆固醇和n-3PUFAs的变化可能是去氢孕酮干扰正常昼夜节律的一种途径。(4)去氢孕酮影响了斑马鱼肝脏的生理状态。组织切片结果显示去氢孕酮导致雌性斑马鱼肝脏发生形态学改变,但对雄性斑马鱼肝脏没有影响。红外光谱结果显示去氢孕酮暴露导致雄鱼肝脏中脂质和蛋白质有关的吸收减少和糖类相关的吸收增加,但对雌鱼肝脏的影响不一样。代谢组学结果显示两种性别的斑马鱼肝脏的代谢物本底浓度有差异。且雌鱼肝脏中很多代谢物被去氢孕酮增加,而雄鱼肝脏中大部分代谢物被去氢孕酮降低。这些结果表明去氢孕酮对斑马鱼肝脏的影响有显著的性别差异性。斑马鱼肝脏中与代谢相关的基因存在天然的性别差异性,这可能导致了雌雄肝脏代谢物本底水平的差异。脂质等代谢物对去氢孕酮响应的性别差异可能与细胞色素P450(CYP)酶有关,因为CYP3A65等酶既能代谢去氢孕酮又能代谢脂肪酸等内源性物质。综上所述,去氢孕酮暴露导致了斑马鱼组织形态、生物大分子和小分子代谢物的改变。去氢孕酮主要通过脂肪酸(包括饱和脂肪酸、n-6 PUFAs和n-3 PUFAs)和嘌呤能信号通路的代谢物干扰了斑马鱼的性别分化、生殖和昼夜节律等生理功能。本研究有助于理解和应对孕激素类物质对水生生物的危害。