甘露聚糖结合凝集素(mannanbindinglectin，MBL)为肝细胞分泌的一种血浆糖蛋白，属于C型凝集素超家族中胶凝素家族的成员，是天然免疫系统中重要的模式识别分子。成熟MBL肽链自N端至C端依次有4个结构域：富含Cys的N端区、胶原样区(collagen-likeregion，CLR)、颈区和C端糖识别域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)。MBL在机体抗感染天然免疫中起重要作用。它利用CRD选择性识别和结合多种病原体如细菌、病毒、酵母、利什曼原虫表面的糖结构，又藉其CLR经由凝集素途径激活补体系统，发挥溶菌或间接调理吞噬功能，还能与吞噬细胞表面的胶凝素受体(即C1q受体)结合，起直接调理作用。然而，认识对MBL结构与功能有一些了解，但MBL分子的结构-功能关系及其生物学功能与机制亟待探索。 人类的MBL只有一种成分，而大鼠、小鼠、家兔和恒河猴体内存在2种不同形式的MBL分子，即血清型(MBL-A)和肝型(MBL-C)。胶凝素家族成员在进化过程中高度保守，小鼠MBL(mMBL)与人MBL(hMBL)在氨基酸水平上具有很高的同源性。鉴于mMBL与hMBL结构的高度同源性及其在分布、生物学活性方面的诸多相似，小鼠无疑是研究MBL结构、功能及其机制的良好模型。 第1章Balb/C小鼠MBL基因的克隆 根据已发表的mMBL的cDNA序列，采用Primerpremier5.0软件，设计并合成2对引物。以Balb/C小鼠肝脏cDNA为模板进行PCR，得到小鼠MBL基因cDNA片段，克隆入pUCm-T载体，PCR鉴定并测序。阳性质粒分别命名为pmMBL-A和pmMBL-C。序列分析发现：pmMBL-C与已发表序列完全相同；pmMBL-A与已发表序列仅1个碱基不同(其426位碱基由A变为G)，两者的同源性达99.9％。结果表明我们成功获取了小鼠MBL基因，为进一步的研究奠定了基础。 第2章小鼠MBL糖识别域的原核表达和相关抗体的制备 分别表达小鼠MBL-A和MBL-C的CRD，并制备相关抗体。(1)利用PCR从含有Balb/C小鼠MBL基因的质粒pmMBL-A和pmMBL-C中扩增目的基因片段，构建了重组表达载体pET-41-mMBL-A-CRD、pET-CKS-mMBL-C-CRD和pET32a-mMBL-C-CRD，将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达，表达产物主要以包涵体的形式存在，其相对分子质量(Mr)分别为47000、44000和34000。用梯度透析法进行复性，然后纯化蛋白，以ELISA鉴定表达蛋白具有糖结合活性。(2)对小鼠MBL-A的B细胞优势表位进行预测，合成B细胞识别表位短肽，将其与载体蛋白交联制备免疫原，免疫家兔获得相应抗血清，经ELISA检测其滴度为1∶256000。采用SPG柱对所得抗血清进行纯化，ELISA分析显示所得抗体可与mMBL-ACRD重组蛋白结合。(3)利用pET-CKS-mMBL-C-CRD的表达产物免疫家兔，分离血清后，以pET32a-mMBL-C-CRD表达产物进行ELISA，其抗体滴度为1∶256000，采用亲和层析对所得抗血清进行纯化，Westernblot实验结果显示多克隆抗体能够与mMBL-CCRD蛋白特异性结合。 第3章mMBL-C抑制痢疾杆菌侵袭小肠黏膜的研究 通过ELISA方法鉴定重组mMBL-CCRD蛋白与福氏痢疾杆菌2a裂解物的结合，以FITC和TRITC分别标记重组mMBL-CCRD蛋白和痢疾杆菌进行结合试验观察重组蛋白与细菌的结合，发现重组CRD蛋白可与痢疾杆菌及其裂解物结合，该作用是Ca2+依赖的，且抗mMBL-CCRD多克隆抗体能阻断mMBL-CCRD蛋白与痢疾杆菌的结合。 用2×1011个具链霉素耐药性的痢疾杆菌2a经口服攻击小鼠，建立小鼠肠道细菌感染模型。感染前2d，经口服给予小鼠5mg硫酸链霉素和1mg红霉素并禁食1d，在整个实验过程中喂食含4g/L硫酸链霉素的纯水。攻击前2h，通过静脉注射和口服2种途径分别给予小鼠抗mMBL-CCRD多克隆抗体各0.2mg以阻断mMBL-C与痢疾杆菌的结合，生理盐水为对照。感染72h后，处死小鼠取肠道组织研磨成匀浆涂布于含1g/L链霉素的LB琼脂平板上培养，行菌落计数并计算单位质量肠组织所含链霉素耐药菌的数目；同时观察空肠的组织病理学改变。发现以抗体阻断mMBL-C与痢疾杆菌的结合可导致侵袭肠组织的细菌数量增加，炎症反应增强，表明小肠黏膜表面的mMBL-C分子参与了细菌感染早期的天然免疫防御。