论文部分内容阅读
目的通过检测重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者的CD8+T细胞内Sirt1的表达水平及其与CD8+T细胞IFNγ表达之间的关系,初步探索Sirt1在调节SAA患者T细胞活化方面的作用。通过构建再障小鼠模型,体内给予Sirt1激活剂,探索Sirt1激活剂在促进AA小鼠造血恢复和抑制T细胞活化方面的作用,为SAA发病机制和治疗提供新的研究思路。方法实验对象本研究总共包括自2017年1月-2018年6月于天津医科大学总医院血液科就诊的18例未经治疗的SAA患者,以及16例健康自愿者。动物实验所用小鼠由中国医学科学院放射医学研究所统一购自北京维通利华实验动物技术有限公司,并饲养于中国医学科学院放射医学研究所的动物中心。第一部分SAA患者外周血CD8+T细胞IFNγ表达水平检测。应用PMA,离子霉素和BFA体外诱导活化SAA患者和健康对照的外周血单个核样本后,用流式细胞术检测CD8+T细胞内IFNγ的表达,明确SAA患者外周血CD8+T细胞IFNγ与对照间的差异。第二部分SAA患者外周血CD8+T细胞的Sirt1表达水平检测。磁珠分选SAA患者和健康对照外周血样本中的CD8+T细胞,用q RT-PCR方法检测CD8+T细胞中Sirt1和IFNγ的相对m RNA表达水平,并进行Sirt1和IFNγ表达的相关性分析。第三部分体外评价Sirt1激活剂-SRT3025对SAA患者CD8+T细胞IFNγ表达的影响。此部分研究选取5例未经治疗的SAA患者的外周血样本,在经PMA,离子霉素和BFA活化过程中加SRT3025,流式检测SRT3025处理和非SRT3025处理SAA样品中CD8+T细胞IFNγ和Sirt1的表达差异。第四部分用全身照射加淋巴细胞回输的方法构建模拟再障小鼠模型,在AA小鼠模型中验证Sirt1激活剂SRT3025对CD8+T细胞功能的影响。AA小鼠疾病诱导后体内给予SRT3025干预,在疾病诱导后第17天,检测正常对照组、全身照射组、AA小鼠组和SRT3025干预的AA小鼠组体重、血常规、骨髓病理、血浆IFNγ、外周血CD8+T细胞IFNγ和CXCR4的表达以及骨髓CD8+T细胞NF-κB信号的表达。结果第一部分SAA患者CD8+T细胞的IFNγ表达水平(42.36±6.24)%较正常对照组(1.32±0.35)%明显增高(P<0.05)。第二部分磁珠分选SAA患者的健康自愿者外周血中的CD8+T细胞,SAA组CD8+T细胞中Sirt1的m RNA表达(0.27±0.07)较对照组(1±0.33)明显减低(P<0.05),IFNγm RNA的表达水平(4.90±1.36)较正常对照组(1±0.23)要明显增高(P<0.05)。SAA患者的CD8+T细胞中Sirt1与IFNγ的m RNA表达存在明显的负相关(r=-0.53,P<0.05)。第三部分SRT3025体外干预抑制SAA患者CD8+T细胞的IFNγ表达。SRT3025干预组的SAA患者CD8+T细胞中IFNγ的表达较未干预组明显减低(P<0.05),SRT3025干预组SAA样本的CD8+T细胞中Sirt1的表达较未干预组明显升高(P<0.05)。第四部分AA组小鼠体重(20.96±0.30)g较正常对照组小鼠(22.70±0.21)g明显减低(P<0.05),SRT3025干预的AA组小鼠(21.98±0.16)g体重较单纯AA组(20.96±0.30)g明显增高(P<0.05)。AA组小鼠外周血WBC、Hb、PLT较正常对照组均明显减低(P<0.05);SRT3025干预的AA小鼠外周血WBC、Hb、PLT均较AA组小鼠明显升高(P<0.05);小鼠胸骨骨髓病理HE染色分析发现,与正常对照组小鼠相比,再障小鼠骨髓造血功能明显减低,骨髓有核细胞明显减少,SRT3025干预的再障小鼠骨髓造血功能较再障小鼠明显好转,骨髓有核细胞明显增多;AA小鼠组血浆中IFNγ表达水平(288.90±44.11)pg/ml较正常对照组(3.92±1.44)pg/ml和TBI组小鼠(52.60±4.95)pg/ml均明显增高(P<0.05);而经SRT3025干预的AA组小鼠血浆中的IFNγ(68.20±15.14)较单纯AA组(288.90±44.11)pg/ml明显减低(P<0.05);AA小鼠的外周血CD8+T细胞表面CXCR4的表达较正常对照组小鼠明显升高(P<0.05),SRT3025干预的AA小鼠外周血CD8+T细胞的CXCR4的表达较单纯AA组明显减低(P<0.05);SRT3025抑制AA小鼠骨髓CD8+T细胞的NF-κB信号的表达。AA组小鼠骨髓CD8+T细胞的NF-κB/p52和NF-κB/p65的表达明显增强,SRT3025干预的AA组小鼠骨髓CD8+T细胞中NF-κB/p52和NF-κB/p65的表达较TBI组和单纯AA组均明显减低。结论1、与正常对照相比,初治SAA患者外周血CD8+T细胞中IFNγ表达升高。2、初治SAA患者外周血CD8+T细胞中IFNγ相对m RNA水平增高、Sirt1相对m RNA水平表达减低,SAA患者CD8+T细胞中Sirt1与IFNγ表达存在显著相关性。3、药物诱导Sirt1表达抑制SAA患者CD8+T细胞的IFNγ表达。4、Sirt1的激活剂-SRT3025促进抑制NF-κB信号抑制CD8+T细胞的功能,并促进AA病情恢复5、SAA患者中Sirt1信号表达下调可能与其CD8+T细胞功能亢进有关,Sirt1可通过抑制NF-κB信号通路调节CD8+T细胞的功能,针对Sirt1信号途径的靶向治疗有可能成为SAA治疗的一个新思路。