肿瘤作为机体的新生物,它的生长、分化、转移不仅受某些特定基因的影响,同时其所处的生存环境也影响其某些生物行为。我们称肿瘤直接生存的环境为”肿瘤微环境”,它一方面为肿瘤提供源源不断的营养和生长环境,另一方面配合肿瘤逃逸免疫抵抗,协助肿瘤细胞转移侵袭。除了间质细胞、上皮细胞外,主要还包含各种免疫淋巴细胞及其分泌的炎症因子等。免疫微环境中的各种免疫淋巴细胞群中T淋巴细胞、自然杀伤细胞等是肿瘤杀伤效应主要的执行者。此外,具有免疫抑制性的淋巴细胞,例如肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞等也参与整个肿瘤微环境的调节。通常这两类细胞的数量在正常人体内处于动态平衡状态,而在肿瘤微环境中抑制性淋巴细胞的募集数量往往多于杀伤性淋巴细胞,导致肿瘤的生长、分化。两者所占的比例及其生物活性直接影响肿瘤的多种生物学行为同时和病人的预后息息相关。立体定向体部放疗在肿瘤的治疗中扮演着越来越重要的作用,以往的研究表明,立体定向放射疗法对肿瘤细胞的杀伤作用主要分为直接杀伤作用和间接杀伤作用。除了射线物理照射直接导致细胞DNA链的断裂而造成细胞的死亡外,立体定向体部放疗还可以通过引起一系列细胞内外的变化,最终导致细胞凋亡、焦亡和坏死等。其中,立体定向体部放疗尤其是大剂量短疗程的放射治疗可以通过调节肿瘤免疫微环境中各免疫淋巴细胞及其炎症因子缓解和抑制肿瘤的生长。这一发现为大分割立体定向体部放射治疗与免疫治疗的联合应用开拓了新思路。WEE1激酶属于WEE家族一员,其主要功能是通过负性调节与细胞周期有关的cdk1-cyclin复合体而使受损DNA细胞停滞于G2-M期,在这个时期受损的DNA进行修复后进入正常的有丝分裂。ATR作为WEE1分子的上游,已被证实可以通过STAT1/3-IRF1-PD-L1途径上调癌症细胞PD-L1的表达。AZD1775作为WEE1激酶的抑制剂之一,受损细胞在其作用下可以避免修复而快速通过细胞周期,导致大量错误复制的细胞积累最后导致细胞的死亡。AZD1775对肿瘤微环境中免疫细胞及免疫检查点的调节目前仍没有较为详尽的阐述,本研究发现AZD1775可以通过STAT1/3-IRF1-PD-L1途径下调大分割放射治疗后癌细胞表面的PD-L1的表达,与此同时AZD1775与大分割立体定向体部放疗的联合可以通过升高具有抗原提呈功能的DC细胞的表达从而增加CD8+T细胞及其毒性因子Granzyme B的数量。除此之外,联合治疗抑制了MDSCs的表达。该研究为WEE1激酶抑制剂在临床的应用提供了良好的证据。第一部分研究目的1.研究WEE1抑制剂与大分割立体定向体部放疗在小鼠模型中对免疫微环境的影响;2.探讨WEE1抑制剂联合大分割立体定向体部放疗抑制小鼠模型肿瘤的机制。研究方法1.通过WB实验方法鉴定肿瘤细胞中不同浓度与作用时间WEE1抑制剂与PD-L1的表达强度与关系;2.通过构建免疫正常的小鼠模型,检测各组小鼠肿瘤体积的抑制的程度;3.通过构建免疫正常的小鼠模型,用流式细胞检测技术分别检测肿瘤免疫微环境中T淋巴细胞,如CD4/8+T淋巴细胞、DC细胞、Treg细胞、MDSC细胞、TAM细胞等;以及免疫检查点抑制剂PD-L1在肿瘤免疫微环境的表达情况;4.通过构建免疫正常的小鼠模型,AZD1775联合大分割立体定向体部放疗的免疫调节机制。实验结果1.WEE1抑制剂AZD1775下调肿瘤细胞中PD-L1的表达:AZD1775单药作用及与立体定向体部放疗联合作用肿瘤细胞后,WB实验检测到肿瘤细胞总PD-L1的下调,流式细胞术检验到肿瘤细胞膜表面PD-L1的下调;2.联合治疗延缓小鼠负荷肿瘤的生长:AZD1775单药、立体定向体部放疗、联合治疗组与空白组相比有明显的抑制肿瘤体积的作用,其中联合治疗组的延缓效果最好;3.流式细胞术检测后分析发现,联合治疗可以上调CD8+T淋巴细胞、树突状细胞、Granzyme B细胞毒性分子的表达,同时可以下调MDSC淋巴细胞的表达;4.AZD1775通过STAT3-IRF-1-PD-L1途径抑制PD-L1的表达:磷酸化酶微阵列实验证明AZD1775可以抑制p STAT3的表达;WB实验表明在AZD1775与立体定向体部放疗联合的条件下,可以通过抑制p STAT3和IRF-1的表达下调PD-L1的表达水平。结论AZD1775联合立体定向体部放疗通过STAT3-IRF-1-PD-L1途径抑制肿瘤细胞PD-L1的表达;抗肿瘤效应主要依赖于CD8+T淋巴细胞以及下调MDSC免疫抑制性淋巴细胞的表达。第二部分研究目的探究本病例队列中56Gy剂量的立体定向放射治疗(SBRT)对原发型超中央性肺癌患者的治疗疗效和毒性。研究方法我们回顾性研究了2010年至2018年之间接受56Gy剂量的立体定向体部放疗的原发性UCLC患者。Kaplan-Meier法被运用于评估总生存期(OS),肿瘤局部控制(LC)和无进展生存期(PFS)。单变量log-rank检验和多变量Cox回归分析评估预后变量。相关毒性参考NCI-CTCAE5.0版进行分级。研究结果共58例患者被纳入本研究,队列中位年龄为68岁(43-85)。其中74.6%的患者在接受本次立体定向体部放疗之前未接受任何治疗。PTV的中位数剂量为77.8Gy(43.3-91.8),PTV的中位数为60.2 cm3(12.9-257.4)。平均随访57个月(6-90个月),中位累积OS为58个月(2-105)。此外,1年,2年和5年OS和LC分别为94.7%、91.5%和75.0%;78.0%、45.0%和58.6%。在我们的单变量分析中(p=0.020)以及多变量分析(p=0.025)得出OS与PTV相关。PTV<53.0 cm3和PTV≥53.0 cm3的患者的5年OS分别为61.6%和37.4%。就SBRT后毒性而言,有3例3≥级呼吸困难者(5.2%),其中1例因突然的非放疗的严重咯血死亡。研究结论立体定向体部放疗以56Gy分割7或8次的剂量分割方案可以用于超中央型肺癌。另一方面,较小的肿瘤体积与更好的OS相关。