目的:疟疾是由疟原虫感染人体后引起的一种感染性寄生原虫性疾病,目前疟疾流行于90多个国家,仅2016年,全球因感染疟疾而死亡的患者就达44.5万余人,其中绝大多数为5岁以下的儿童。现已证实,人体感染疟原虫的种类与疾病的进展和结局密切相关。恶性疟原虫和间日疟原虫是目前临床疟疾患者中比较常见的两种感染病原体,其中恶性疟原虫的毒力比较强,主要侵袭成熟的红细胞,患者感染后死亡率较高,临床约99%疟疾死亡病例为恶性疟原虫感染。而间日疟原虫的毒力相对较弱,主要侵袭网织红细胞,感染者死亡率相对较低。人群的免疫力决定了疟疾感染的过程及结局,而机体的免疫状态与年龄有着密切的相关性。儿童因为免疫系统尚未发育完全,无论是细胞免疫还是体液免疫功能相对成人都不成熟。目前研究发现,疟原虫感染人体后的不同时期,存在着不同的免疫细胞发挥着免疫效应,其中在疟疾感染早期,树突状细胞(DC)产生IL-12诱导IFN-γ的分泌,增加Th1细胞免疫应答,随后,Th2细胞活化后产生的细胞因子IL-4辅助B细胞产生抗疟原虫特异性的抗体,有效地清除体内的疟原虫,防止其复发和再燃。然而,对于不同毒力疟原虫感染相同年龄患者免疫应答的何种差异导致感染的不同结局,以及被同种疟原虫感染的不同年龄患者体内免疫细胞和效应分子参与调节抗疟疾的免疫状态有何不同,从而影响感染的进程和最终结局,这些问题的机制目前尚不明确。本研究选取了与宿主为人类的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,Pf)和间日疟原虫(Plasmodium vivax,Pv)具有相似的生物学特性的宿主为鼠的致死性约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)和非致死性约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XNL,P.y17XNL)来模拟恶性疟原虫和间日疟原虫,去感染相当于人类儿童和成年人的4周龄(4W)幼年和8周龄(8W)成年BALB/c小鼠,建立不同鼠龄不同毒力的鼠疟模型,观察小鼠的死亡率和计算疟原虫血症水平。运用流式细胞术,实时定量荧光PCR,酶联免疫吸附测定等方法在感染后的不同时间点动态检测各组小鼠体内的多种免疫细胞及效应分子等的变化,并利用体外实验检测不同周龄小鼠的脾细胞应答能力情况,系统探讨不同毒力疟原虫感染不同年龄小鼠过程中免疫应答和免疫保护的发生特点与小鼠年龄、疟原虫毒力两方面因素是否具有相关性。研究方法:分别选取4周龄和8周龄的BALB/c小鼠,腹腔注射1×106P.y17XL或P.y17XNL寄生的红细胞(PRBC),于注射后的不同时间点动态观察两组小鼠的生存率,尾静脉取血,利用Giemsa染色法动态监测外周血中疟原虫血症的水平。同时在感染后不同时间点分离两组小鼠脾脏,制成脾细胞悬液,计数并用流式细胞术检测脾脏中髓样树突状细胞(m DC)、浆细胞样树突状细胞(p DC)、活化的树突状细胞、巨噬细胞、T细胞各亚群(Th1,Th2,Treg,Tfh细胞)、浆细胞、记忆B细胞以及细胞因子和特异性抗体的分泌,还检测了疟原虫感染后T细胞耗竭相关的表面分子PD-1的表达情况,利用ELISA的方法检测各时间点分离的脾细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-4的表达水平。最后进行体外实验,常规提取4周龄和8周龄正常BALB/c小鼠脾细胞进行体外培养,通过LPS刺激12小时后,ELISA法检测培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2及IL-10的分泌水平。结果:1、P.y17XL和P.y17XNL感染不同周龄BALB/c小鼠后生存率以及疟原虫血症水平。(1)两组小鼠在P.y17XL感染后第5天均开始出现死亡,4周龄小鼠在感染后第7天全部死亡,而8周龄小鼠于感染后11天全部死亡。P.y17XNL感染后4周龄小鼠于第8天即开始出现死亡,随着感染时间的延长,小鼠的生存率继续下降,至感染后的第18天后停止死亡,最终小鼠的生存率仅有77.8%,而8周龄小鼠在感染第18天才出现死亡,最终生存率96.3%。(2)P.y17XL感染后两组小鼠的疟原虫血症的水平均明显升高,4周龄小鼠在感染后的第5天,疟原虫血症的水平显著高于8周龄小鼠。P.y17XNL感染后两组小鼠体内疟原虫血症的水平均从感染后的第3天开始上升,8周龄小鼠相对于4周龄小鼠相比,上升速度缓慢,两组小鼠均在感染后的第11天疟原虫血症的水平达到最高,且4周龄小鼠体内疟原虫血症在感染的第9、11、13、15天均显著高于8周龄小鼠,至感染后的第19天,两组小鼠中疟原虫血症几乎在体内消失。2、P.y17XL和P.y17XNL感染不同周龄BALB/c小鼠树突状细胞的变化。(1)P.y17XL感染初期,两组小鼠m DC和p DC细胞的比例和绝对数量较正常小鼠值均显著上调,p DC细胞8周龄小鼠组显著高于4周龄小鼠组。感染后期,两组小鼠m DC和p DC细胞的比例恢复至正常小鼠水平,但绝对数量较正常小鼠仍显著上调,两组小鼠之间无显著性差异。P.y17XNL感染后,8周龄小鼠m DC和p DC细胞的比例和绝对数量以及4周龄小鼠m DC和p DC细胞绝对数量与正常小鼠相比显著上调,且8周龄小鼠显著高于4周龄小鼠组。(2)在P.y17XL感染后,两组小鼠间DC细胞的活化水平无显著性差异。在P.y17XNL感染后,8周龄小鼠DC细胞表达MHC II类分子以及CD86的表达水平均显著高于4周龄小鼠组。(3)在P.y17XL感染后,仅感染后的第5天,两组小鼠DC细胞表达TLR9的表达水平较正常小鼠显著上调,两组小鼠之间无显著性差异。感染后的各个时间点,DC细胞表达TLR4的表达水平均无显著性差异。在P.y17XNL感染后,两组小鼠DC细胞表面TLR4和TLR9的表达水平均显著性上调,且8周龄小鼠组显著高于4周龄小鼠组。3、P.y17XL和P.y17XNL感染不同周龄的BALB/c小鼠后巨噬细胞的比例变化。在P.y17XL感染后第3天,两组小鼠巨噬细胞比例与正常小鼠相比无显著变化,感染后的第5天较正常小鼠显著上升,但两组小鼠之间无统计学差异。在P.y17XNL感染后的第5天,与正常对照组相比,两组小鼠CD11b+F4/80+巨噬细胞的比例显著增加,且8周龄小鼠组显著高于4周龄小鼠组。4、P.y17XL和P.y17XNL感染不同周龄BALB/c小鼠后Th1细胞和转录因子Tbet m RNA及IFN-γ的变化。(1)P.y17XL感染后,8周龄小鼠组Th1细胞的比例和绝对数量以及4周龄小鼠组Th1细胞的绝对数量都较正常小鼠均显著上调,且8周龄小鼠组无论比例还是绝对数量均显著高于4周龄小鼠组,具有统计学差异。P.y17XNL感染后,8周龄小鼠Th1细胞的比例和绝对数量均显著高于正常对照组小鼠,且显著高于4周龄小鼠。(2)在P.y17XL感染小鼠中,8周龄小鼠的T-bet m RNA表达水平在感染后3天和5天均显著高于正常对照组小鼠。而4周龄小鼠Tbet的m RNA水平升高时间滞后于8周龄小鼠,于感染后第5天出现显著升高。在P.y17XNL感染小鼠后第5天,8周龄小鼠的T-bet m RNA表达水平明显高于正常对照小鼠,且显著高于4周龄小鼠组,具有统计学差异。(3)在P.y17XL感染后的第3天和第5天,两组小鼠相比于正常对照组小鼠,脾细胞培养上清中IFN-γ的表达水平均显著上调,且在感染后的第3天,8周龄小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的表达水平显著高于4周龄小鼠。P.y17XNL感染后,两组小鼠相比于正常小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的表达水平均显著上调,且8周龄小鼠的表达水平要显著高于4周龄小鼠。5、P.y17XNL和P.y17XL感染不同周龄BALB/c小鼠后CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞和IL-10表达水平的变化。(1)在P.y17XL感染后的第5天,两组小鼠调节性T细胞的比例较正常对照组小鼠均显著上调,但8周龄小鼠组与4周龄小鼠组之间无显著性差异。在P.y17XNL感染后,8周龄小鼠组脾脏中调节性T细胞比例较正常小鼠显著升高,且显著高于4周龄小鼠组。(2)在P.y17XL感染后的第3天,两组小鼠脾细胞培养上清IL-10的浓度较正常对照小鼠均显著升高,但两组间无显著性差异。感染后的第5天,脾细胞培养上清IL-10恢复至正常小鼠水平,且两组之间无显著性差异。在P.y17XNL感染后,8周龄小鼠脾细胞培养上清IL-10的浓度相较正常对照小鼠显著升高,且显著高于4周龄小鼠。6、P.y17XL和P.y17XNL感染不同周龄BALB/c小鼠后T细胞表面PD-1的表达情况。(1)在P.y17XL感染后的第3天,活化的T细胞表面PD-1的表达在两组小鼠均显著上调,感染后的第5天,两组小鼠无论是总的CD4+T细胞还是活化的T细胞表面PD-1的表达均较正常对照组小鼠显著升高,且8周龄小鼠组CD4+T细胞表面PD-1的表达水平显著高于4周龄小鼠组。在P.y17XNL感染后的第5天,两组小鼠无论是CD4+T细胞还是活化的T细胞表面PD-1的表达与正常对照小鼠相比均显著升高,但两组小鼠之间无显著性差异。感染后的第10天,两组小鼠无论是CD4+T细胞还是活化的T细胞表面PD-1的表达水平均高于正常对照组小鼠,且4周龄小鼠组均高于8周龄小鼠组。(2)在P.y17XL感染小鼠后,两组小鼠的PD-1 m RNA表达水平均明显高于正常对照组小鼠,在感染后第5天时,8周龄小鼠的PD-1 m RNA表达水平显著低于4周龄小鼠。在P.y17XNL感染小鼠后第5天和第10天,4周龄小鼠的PD-1 m RNA表达水平显著高于正常对照组小鼠,8周龄小数组在感染第10天显著高于对照组小鼠,且在感染第5和第10天,8周龄小鼠PD-1 m RNA表达水平均明显低于4周龄小鼠组,具有统计学差异。7、P.y17XNL感染不同周龄BALB/c小鼠体液免疫应答的变化情况。(1)4周龄小鼠和8周龄小鼠感染后的第5和第10天与正常对照组小鼠相比,Th2细胞比例和绝对数量均显著升高,且8周龄小鼠Th2细胞的比例和绝对数量在感染后的第5和第10天均显著高于4周龄小鼠,具有统计学差异。(2)IL-4是Th2细胞发生应答的重要效应性细胞因子,感染后的第5和第10天,两组小鼠相比于正常小鼠,脾细胞培养上清中IL-4的表达水平均显著升高。且8周龄小鼠IL-4的水平显著高于4周龄小鼠。(3)在感染第5天,4周龄和8周龄小鼠滤泡辅助性T细胞的绝对数量显著高于正常对照组小鼠,但两组之间无统计学差异。在感染第10天,4周龄和8周龄小鼠滤泡辅助性T细胞的绝对数量显著高于正常对照组小鼠,且8周龄小鼠的比例和绝对数量均显著高于4周龄小鼠,具有统计学差异。(4)P.y17XNL感染以后,4周龄小鼠CD138+B220-Ig G+浆细胞的比例在感染后的各个时间点与正常对照组小鼠无显著性差异,其绝对数量在感染后的第5天和第10天与正常对照组小鼠相比均显著上升,具有统计学差异,但是仍然处于较低的水平。8周龄小鼠CD138+B220-Ig G+浆细胞的比例在第10天显著上升,且显著高于4周龄小鼠,其绝对数量在感染后的第5天有上升,且与正常对照组小鼠相比具有统计学差异,而感染后的第10天,其绝对数量上升程度尤其显著,具有统计学差异。8周龄小鼠CD138+B220-Ig G+浆细胞比例和绝对数量与4周龄小鼠相比,在感染后的第5天无显著性差异,在感染后的第10天,两组间差异有统计学意义。B220+Ig G+记忆性B细胞感染以后的变化趋势与CD138+B220-Ig G+浆细胞的趋势相似,8周龄小鼠的B220+Ig G+记忆性B细胞在感染第10天比例和绝对数量都较正常对照组小鼠显著上升,且显著高于4周龄小鼠。(5)感染P.y17XNL自愈后的小鼠血清中总Ig G及不同亚型的保护性抗体表达水平。4周龄小鼠与正常对照组小鼠相比,总Ig G水平显著上调,Ig G1和Ig G2a无统计学差异,而8周龄小鼠组无论是总Ig G还是Ig G1和Ig G2a,与正常对照组小鼠相比均显著上升,且显著高于4周龄小鼠水平。8、体外实验。4周龄和8周龄小鼠的脾细胞经LPS刺激12小时后,8周龄小鼠的IFN-γ和IL-2的水平显著高于对照组小鼠,且显著高于4周龄小鼠。而4周龄和8周龄小鼠脾细胞培养上清中IL-10的水平显著高于对照组小鼠,且8周龄小鼠明显低于4周龄小鼠。结论:1、无论在强毒力的致死性疟原虫还是弱毒力的非致死性疟原虫感染的早期,成年小鼠增强的Th1细胞免疫应答促进机体早期对疟原虫的遏制能力强于幼年小鼠。2、在弱毒力非致死性疟原虫感染时,实验结果提示幼年小鼠相对于成年小鼠T细胞的耗竭增多,不利于疟原虫的清除。成年小鼠较幼年小鼠具有更强的激活固有免疫应答和适应性免疫应答的能力,增强的Th2细胞和Tfh细胞有更强的能力参与促进B细胞向浆细胞和记忆性B细胞分化,产生特异性抗体,清除疟原虫的感染。3、体外实验证实,幼年和成年小鼠的脾细胞数量上没有明显差异,但在应答能力上,成年小鼠显著强于幼年小鼠。因此当感染发生时,幼年和成年小鼠的保护性免疫应答会出现较大的区别,从而影响了各自的感染结局。