研究背景随着社会经济和科学技术的发展,由交通事故、体育运动、自然灾害、战争、工程施工事故等多种原因导致的全身性机械性创伤日益增多。机械性创伤已成为严重的医学和社会问题。现代社会,创伤的表现更为复杂多样,创伤不仅可以引起直接的脏器损伤,还可以通过致伤因子作用于人体,造成多部位和多脏器的损伤。统计显示,创伤伤员多为青壮年,而他们是社会财富的主要创造者,因而创伤救治具有重要的社会意义。创伤可以导致直接的心脏损伤,严重的可以致患者死亡。随着医疗技术的发展,由创伤所导致患者的直接死亡率已大大降低。然而,有临床研究报道,一些全身机械性创伤患者,在创伤后的24小时观察期内,生命体征稳定、心脏及其他脏器亦无临床可检测到的损伤,然而部分患者在出院后的数天乃至数周发生了心肌梗死等心脏事件。这些提示,全身机械性创伤不仅可以引起直接的心脏损伤,还可以引起迟发性心脏损伤。由于这类患者在临床上容易被遗漏,且后果严重,所以对此类患者的关注显得尤为重要,但是非致死性创伤引起迟发性心脏损伤的具体机制尚不明确。研究表明,机体受到损伤后,可以引起细胞内外环境紊乱、代谢功能障碍等改变。在神经系统和内分泌系统的调节下,机体会对内环境的各种变化做出相应的调整,进而维持机体的自身稳态平衡,这种反应本质上是机体的一种自稳保护机制。有研究表明,自噬在维持机体的自身稳态中发挥着重要的作用。自噬是一种保守的细胞行为,它可调控线粒体等多种细胞器的更新,利用降解产物提供能量并重建细胞结构,以维持代谢平衡和内环境稳态。白噬在应激状态下可以被激活,以延长细胞的寿命。然而当机体自噬能力不足时,可导致细胞内线粒体等重要细胞器清除障碍,进而引起重要脏器的损伤。自噬维持机体稳态的一个重要机制是清除细胞内损伤的线粒体。线粒体是细胞内能量代谢的主要场所,线粒体对机体各种损伤最为敏感,当损伤的线粒体没有被及时有效的清除,进而会引起组织或器官功能损伤。自噬在机体损伤的调控机制中发挥着重要的作用,那么,在全身性非致死性机械性创伤后,心肌自噬水平是否发生了改变?如果有改变这一改变对创伤后的迟发型心脏损伤有何意义是本课题关注的重要内容。本研究将采用离体、在体实验模型和药理学药物干预等方法,探寻创伤后心脏功能损伤的原因及其可能机制,为寻找早期防治创伤后多器官功能衰竭的最佳方法提供实验依据。目的1观察非致死性机械性创伤后心肌组织自噬的改变。2从在体及离体水平明确心肌自噬的改变在非致死性创伤后迟发性心脏损伤中的作用。3寻找在非致死性创伤致迟发性心脏损伤过程中可能发挥作用的血清蛋白。材料与方法1材料1.1实验动物健康雄性Wistar大鼠,体重180-220g,由山西医科大学实验动物中心提供。实验动物的使用遵循中华人民共和国卫生部令(第55号)——医学实验动物管理实施细则。1.2细胞株H9c2(2-1)心肌细胞株：购白中科院上海细胞库。2实验分组2.1在体实验分组2.1.1创伤组(Trauma):大鼠麻醉后,放入直径30.5cm的Noble-Collip鼓中,以40转/mmin的转速转动5min；2.1.2伪创伤组(Sham):将麻醉后大鼠用胶带黏贴固定于创伤仪中,只随创伤仪转动而不由高处跌落；2.1.3自噬激动剂+创伤组(Trauma+RAPA)创伤前30min给予自噬的激动剂Rapamycin (RAPA),8mg/kg,摔伤过程同上。2.2离体实验分组2.2.1正常细胞组：给予正常的DMEM培养基及10%的胎牛血清,置于5%CO2孵箱培养；2.2.2于预组：给予正常的DMEM培养基,分别用创伤后1h、3h、6h、12h、24h15%的大鼠血清取代胎牛血清进行细胞培养；2.2.3SiRNA组：导入SiRNA质粒,沉默H9c2(2-1)心肌细胞自噬基因Beclin1,用创伤后1h、3h、6h、12h、24h15%的大鼠血清取代胎牛血清进行细胞培养。3方法3.1机械创伤模型标本的留取实验结束后腹主动脉取血,分别取伪创伤组及创伤后1h、3h、6h、12h、24h大鼠的动脉血；取血后,留取各纠大鼠心脏标本待测。3.2H9c2(2-1)细胞株标本的留取实验结束后,留细胞培养的上清待用；留取上清后,按实验要求将各组细胞标本裂解后待测。3.3检测指标的测定3.3.1大鼠心电图(ECG)、平均动脉压(MABP)及在体心功能的检测；3.3.2大鼠离体心功能的检测；3.3.3大鼠心肌组织结构及荧光蛋白表达检测(HE染色、免疫荧光)；3.3.4血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌钙蛋白(cTnl)检测(ELISA法)；3.3.5血清甲状腺激素[游离三碘甲腺原氨酸(FT3),游离甲状腺素(FT4),促甲状腺激素(TSH)]检测(放射免疫法)：3.3.6心肌组织LC3Ⅱ Beclinl的蛋白含量测定(Western blot);3.3.7心肌组织LC3Ⅱ Beclinl的mRNA含量测定(real-time PCR);3.3.8线粒体膜电位检测(JC-1法)：3.3.999mTc-MIBI核素心肌显像线粒体功能的检测；3.3.10细胞计数Kit-8检测创伤血清对H9c2(2-1)细胞存活的影响;3.3.11细胞培养上清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量的测定(ELISA去)：3.3.12心肌细胞LC3Ⅱ、Beclinl的蛋白含量测定(Western blot);3.3.13心肌细胞LC3Ⅱ、Beclinl的mRNA含量测定(real-time PCR);3.3.14shRNA表达载体的构建及鉴定；3.3.15细胞转染及筛选；3.3.16细胞因子蛋白芯片的检测；3.3.17血清白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、干扰素γ (IFN-γ)、中性粒细胞趋化因子3(CINC-3)及睫状神经营养因子(CNTF)检测(ELISA法);结果1非致死性机械创伤大鼠创伤模型建立成功1.1机械性创伤后24h内大鼠呼吸、心率、心电图等一般情况正常与伪创伤组相比,创伤后24h内各时间点ECG T波及ST段未出现明显变化(P>0.05)。与伪创伤组相比,创伤后24h内各时间点大鼠心率及呼吸频率未出现明显变化(P>0.05)。麻醉大鼠一般在创伤后1.5h左右自然苏醒,24h内大鼠生存率为100%。1.2机械性创伤后24h内大鼠平均动脉压(MABP),在体心功能及心肌组织结构未出现明显改变与伪创伤组相比(103.20±12.42mmHg),创伤后即刻MABP出现明显降低(79.92±12.08mmHg)(P<0.01),约1h左右恢复正常后,24h内末再次出现异常。与伪创伤组相比,创伤后24h内大鼠LVDP,+dP/dTmax和-dP/dTmax均无明显差异(P>0.05)。与伪创伤组相比,创伤后24h内大鼠心肌组织的结构未出现明显改变,无炎性细胞浸润。1.3机械性创伤后24h内大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌钙蛋白(cTnl)无明显改变与伪创伤组相比,创伤后24h内大鼠CK-MB及cTnl未出现明显改变(P>0.05)。1.4机械性创伤后24h内大鼠血清中甲状腺激素(FT3、FT4、TSH)未出现明显改变与伪创伤组相比,创伤后24h内大鼠FT3、FT4及TSH未出现明显改变(P>0.05)。1.5机械创伤后24h大鼠离体心功能降低与伪创伤组相比,创伤后24h内大鼠LVDP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均显著下降[LVDP:(87.5±11.6) mmHg, vs.(103.0±8.9) mmHg, P<0.05;+dP/dTmax:(2060.0±266.6) mmHg/sec, vs.(2830.16±395.3) mmHg/sec,P<0.01;-dP/dTmax:(-1666.5±243.4) mmHg/sec vs.(-2048.3±282.9) mmHg/sec, P<0.05]。2心肌组织自噬水平下降可能是创伤后心功能损伤的重要原因2.1机械性创伤后24h内大鼠心肌组织自噬水平降低2.1.1创伤后不同时间点Beclin1蛋白水平和1nRNA水平的改变与伪创伤组(0.94+0.23)相比,创伤后1h Beclin1蛋白表达下降(0.59+0.10,P<0.05),至创伤后3h降至最低(0.30±0.15,P<0.01),之后逐渐恢复,创伤后24h恢复至正常水平(1.04±0.18,P>0.05)。与伪创伤组相比(1.00±0.15),创伤后Ih Beclin1mRNA水平开始下降(0.49+0.11,P<0.05),3h降至最低(0.32+0.22,P<0.01),之后逐渐恢复,至24h恢复至正常水平(1.17±0.56,P>0.05)。2.1.2创伤后不同时间点LC31I蛋白水平和mRNA水平的改变与伪创伤组(1.01±0.12)相比,创伤后1h LC3Ⅱ蛋白表达下降(0.62±0.16,P<0.05),至创伤后6h降至最低(0.30±0.14,P<0.01),之后逐渐恢复,创伤后24h恢复至正常水平(1.08±0.32,P>0.05)。与伪创伤组相比(0.98+0.13),创伤后1hLC3ⅡmRNA表达下降(0.46±0.16,P<0.05),6h降至最低(0.34±0.15,P<0.01),之后逐渐恢复,至24h恢复至正常水平(0.98±0.40,P>0.05)。2.2升高自噬水平可以改善创伤后离体心功能的异常2.2.1自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)可以上调自噬2.2.1.1给予RAPA后,Beclin1蛋白水平和mRNA水平上调与伪创伤组相比(1.14±0.33),创伤后Beclin1蛋白水平显著下降(0.52±0.15,P<0.05vs. Sham),创伤前30min给予RAPA可以显著上调创伤后Beclin1蛋白水平(1.18+0.26,P<0.05vs. saline)。与伪创伤组相比(1.18±0.29),创伤后Beclin1mRNA水平显著下降(0.74±0.15,P<0.05),创伤前30min给予RAPA可以显著上调创伤后Beclin1mRNA水平(1.03+0.26,P<0.05)。2.2.1.2给予RAPA后,LC3Ⅱ蛋白水平和mRNA水平上调与伪创伤组相比(1.28±0.29),创伤后LC3Ⅱ蛋白水平显著下降(0.69±0.15,P<0.05),创伤前30mmin给予RAPA可以显著上调创伤后LC3Ⅱ蛋白水平(1.13±0.26,P<0.05)。与伪创伤组相比(1.00±0.28),创伤后LC3ⅡmRNA水平显著下降(0.55±0.13,P<0.01),创伤前30mmin给予RAPA可以显著上调创伤后LC3Ⅱ mRNA水平(0.86±0.31,P<0.05)。2.2.1.3给予RAPA后,Beclin1和LC311免疫荧光聚点增多采用激光共聚焦技术观察LC3II及Beclin1(?)荧光表达。与伪创伤组相比,创伤后心肌组织LC3II及Beclin1蛋白聚点减少,提示其表达降低(P<0.05),而给予RAPA后,LC31I及Beclin1的表达升高,与创伤组相比具有统计学差异(P<0.05)。2.2.2上调自噬可以改善创伤后24h离体心功能异常创伤前30mmin给予RAPA后,与创伤组相比,治疗组离体心功能指标LVDP、+dP/dTmax和-dP/dTmax均显著回升[LVDP:(94.3±9.8) mmHg, vs.(87.5±11.6) mmHg, P<0.05;+dP/dTmax:(2663.0±332.2) mmHg/sec, vs.(2060.0±266.6) mmHg/sec, P<0.01;-dP/dTmax:(-1914.8±215) mmHg/sec vs.(-1666.5±243.4) mmHg/sec, P<0.01]。3上调自噬可以改善创伤后心肌线粒体功能障碍3.1创伤后大鼠心肌组织线粒体膜电位下降采用JC-I法检测线粒体膜电位。当线粒体膜电位正常时,JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,产生红色荧光；当线粒体膜电位降低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,以单体形式存在,产生绿色荧光。结果显示,伪创伤组线粒体膜电位显示红色,而创伤组线粒体膜电位为绿色。3.2上调自噬可以改善创伤后心肌线粒体功能障碍采用核素99mTc-MIBI检测心肌线粒体功能。结果显示,与伪创伤组相比(1.96±0.13),创伤后心肌线粒体对99mTc-MIBI的摄取降低(1.68±0.19,P<0.05),而创伤前给与RAPA后,心肌对99mTc-MIBl的摄取显著提高(1.94±0.20,P<0.01)。4自噬改变在创伤后血清导致心肌细胞损伤中的意义4.1创伤后血清引起心肌细胞损伤模型建立用正常胎牛血清(control组)培养H9c2细胞3h、6h、12h、24h及48h后,各时间点细胞的存活率无统计学差异(P>0.05);用伪创伤组大鼠血清(Sham(?))培养H9c2细胞3h、6h、12h、24h及48h后各时间点细胞的存活率无统计学差异(P>0.05)；与control组相比,用Sham组大鼠血清培养细胞后存活率无统计学差异(P>0.05)；与Sham组相比,将创伤后3h血清加入H9c2细胞,培养3h后细胞存活率显著下降(P<0.05),培养12h降至最低(P<0.01);将创伤后6h血清加AH9c2细胞,与Sham且相比,培养3h细胞存活率显著下降(P<0.05),培养12h下降最为明显(P<0.01)。4.2创伤后不同时间点血清培养H9c2细胞12h后培养液中CK及LDH变化与伪创伤组[(138.33±17.18)U/L]相比,创伤后12h血清培养细胞后培养液中CK含量明显升高[(160.16±18.85) U/L,P<0.05]。与伪创伤组[(112.40±12.13)U/L]相比,创伤后12h血清培养的细胞培养液中LDH含量明显升高[(141.80±15.19)U/L,P<0.05]。4.3创伤后不同时间点血清培养H9c2细胞后自噬的变化4.3.1Beclinl蛋白水平和mRNA表达升高与伪创伤组(1.08±0.32)相比,创伤后3h血清培养细胞后,Beclin1蛋白水平升至最高(1.76±0.55, P<0.00.1vs. Sham),之后逐渐恢复,创伤后24h恢复至常水平(1.18±0.28,P>0.05)。与伪创伤相比(1.00±0.54),创伤后3h血清培养细胞12h后,Beclin l mRNA升至最高(1.63±0.24,P<0.01),之后逐渐恢复。4.3.2LC3Ⅱ蛋白水平和mRNA表达升高与伪创伤组(1.11±0.27)相比,创伤后6h血清培养后LC3Ⅱ蛋白水平升至最高(1.82±0.64,P<0.01),之后逐渐恢复,创伤后24h血清培养12h后恢复至正常水平(1.25±0.46,P>0.05)。与伪创伤组相比(1.01±0.17),创伤后12h血清培养细胞12h后LC3Ⅱ mRNA水平升至最高(1.85±0.43,P<0.01),之后逐渐恢复,创伤后24h血清清培养12h后恢复至正常水平(1.08+0.18,P>0.05)。4.4将pSUPER-Beclin1转染H9c2细胞后自噬的变化4.4.1Beclinl蛋白及mRNA含量的变化与正常细胞相比(1.15±0.20),将质粒pSUPER-Beclin1导入H9c2后,Beclinl蛋白水平明显下降(0.58±0.17,P<0.05)；而导入空质粒pSUPER-non后,Beclinl蛋白水平基本没有变化(1.32±0.24,P>0.05)。与正常细胞相比(0.95±0.24),将质粒pSUPER-Beclin1导入H9c2后,Beclinl mRNA水平明显下降(0.39±0.08,P<0.05)；而导入空质粒pSUPER-non后,Beclinl mRNA水平基本没有变化(0.89±0.19,P>0.05)。4.4.2LC3Ⅱ蛋白及mRNA含量的变化与正常细胞相比(1.08±0.26),将质粒pSUPER-Beclin1导入H9c2后,LC3Ⅱ蛋白水平明显下降(0.56±0.10,P<0.05)；而导入空质粒pSUPER-non后,LC3Ⅱ蛋白水平基本没有变化(0.97±0.25,P>0.05)。与正常细胞相比(0.93±0.20),将质粒pSUPER-Beclin1导入H9c2后,LC3Ⅱ mRNA水平明显下降(0.48±0.08,P<0.05)；而导入空质粒pSUPER-non后,LC3Ⅱ mRNA水平基本没有变化(0.97±0.24,P>0.05)。4.5创伤后不同时间点血清培养转染pSUPER-Beclin1的H9c2细胞12h后,细胞出现损伤4.5.1细胞存活率的降低与伪创伤组相比(104.90±16.92),加入创伤后6h的血清后,H9c2细胞存活率降到最低(51.30±10.70,P<0.01)。4.5.2细胞培养液中CK及LDH升高与伪创伤组相比(143.00±15.32)U/L,加入创伤后12h的血清CK含量升至最高[(243.50±35.05)U/L,PP<0.01]。与伪创伤组相比(112.40±12.03)U/L,加入创伤后12h的血清LDH含量升至最高[(201.80±16.30)U/L,PP<0.01]。5创伤后血清中与应激有关的细胞因子蛋白芯片筛查5.1创伤后血清中5种细胞因子升高创伤后1h血清中,IL-I bate、TNF-alpha、IFN-gamma、CINC-3、CNTF均显著升高,与伪创伤组相比有统计学差异(P<0.05)。5.2创伤后不同时间点血清中TNF-α含量升高与伪创伤组相比(66.57±14.18) pg/ml,创伤后即刻’TNF-α含量升至最高(178.00±39.81,P<0.01) pg/ml。此后逐渐回落,至创伤后24h基本降至正常水平[(77.33±19.45) pg/ml], P>0.05。5.3创伤后不同时间点血清中IL-18含量升高与伪创伤组相比(29.48±11.07) pg/ml,创伤后1h血清中含量升至最高[(29.48±11.07)pg/ml, P<0.01],之后开始回落,至创伤后6h血清中含量基本恢复正常水平[(27.30±9.72) pg/ml, P>0.05]。5.4创伤后不同时间点血清中IFN-γ含量升高与伪创伤组相比(1.12±0.14)pg/ml,创伤后6h血清中含量升至最高[(19.87±1.67) pg/ml, P<0.01],之后开始回落,但至创伤后24h血清中含量仍维持在较高水平。5.5创伤后不同时间点血清中CINC-3含量升高与伪创伤组相比(67.62±8.57) pg/ml,创伤后3h血清中CINC-3含量升至最高[(375.10±52.13) pg/ml, P<0.01],之后开始回落,创伤后12h血清中含量基本降至正常水平[(59.31±12.61) pg/ml, P>0.05]。5.6创伤后不同时间点血清中CNTF含量升高与伪创伤组相比(0.16±0.03) pg/ml,创伤后即刻即出现明显升高(1.22±0.22, P<0.01) pg/ml,至创伤后6h血清中CNTF含量升至最高[(3.29±0.84) pg/ml, P<0.01],之后开始回落,但至创伤后24h血清中CNTF含最仍维持在较高水平[(1.16±0.20) pg/ml,P<0.01]。结论1全身性非致死性机械性创伤可以导致心肌组织自噬水平下降。2心肌组织自噬水平的下降可能是导致创伤后心肌线粒体功能障碍及离体心功能异常的原因之一。3创伤后血清可以导致H9c2心肌细胞损伤,抑制心肌细胞自噬可以加重创伤后血清对心肌细胞的损伤。4血清中导致心肌细胞损伤的病理性介质可能为IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CINC-3及CNTF中一种或几种。