胚胎干细胞(ESCs)作为多能干细胞,能在体外自我更新和分化成所有的体细胞,可作为其他细胞的种子细胞。胚胎干细胞的特殊性质使其成为非常热门的研究对象。研究显示,胚胎干细胞的生长分化无论在体内还是体外受到各种因素的影响,如细胞周围物理力学环境、可溶性因子、细胞相互作用、外源基因干扰等。已有研究围绕单一力学性质,仅硬度或者拓扑,或者仅研究定向分化,而并没有将硬度、拓扑和定向分化结合起来的研究,而在体内分化过程中微环境的力学性质并非单一存在。因此为了更好地模拟体内微环境,有必要将硬度和拓扑耦合,研究其对胚胎干细胞的生长分化调控。此外,研究揭示外源基因干扰胚胎干细胞可改变其正常生长和分化状态,可认识和了解细胞生长和分化机制,发现未知基因和已知基因新的功能,然而胚胎干细胞的基因转染效率很低,有待优化其转染载体,提高其转染效率。基于基底力学微环境和基因转染可影响胚胎干细胞的命运,本文以人胚胎干细胞(hESCs)为研究对象,探讨了硬度和拓扑耦合的微模式化基底以及基因转染载体的物理化学因素对胚胎干细胞的生长分化的影响,为了解和认识微模式化基底影响hESCs的生长和肝向分化机理、为优化设计hESCs的基因转染载体提供理论支持。研究的内容和结果如下:首先本课题选取常见的硬度可调节的聚丙烯酰胺水凝胶,通过微模式化制作技术,制备了两种硬度(分别为6.1和46.7 kPa)、四种拓扑结构(分别为柱状、沟槽、六边形、平面),硬度耦合拓扑结构的八种基底。所制备的基底经过处理后,将hESCs接种在其上,培养三天后加入不同的诱导分化因子,通过一系列的分化流程,将hESCs诱导分化为类肝细胞。对细胞形态变化、蛋白和基因水平标志物的检测和肝细胞功能的考察,发现在不同的生长分化时期,硬度和拓扑起不同的作用:在干性维持阶段,软、硬胶都有利于干性维持,软胶上的细胞比硬胶的表达更多的Nanog和Oct-4,沟槽结构不利于干性维持;确定内胚层分化阶段,硬胶上的细胞易分化,六边形和柱状对分化影响最大;在前体肝细胞分化阶段,软胶有利于类肝细胞功能维持,平面和柱状表达更多的肝细胞特异性标志物;在成熟的肝细胞阶段,软胶优于硬胶,拓扑结构对类肝细胞功能没有明显影响。硬度在分化的过程中起决定性作用,拓扑结构对分化有部分作用,研究结果提示在胚胎干细胞分化及体外肝细胞培养中,应该考虑到硬度和拓扑结构的影响,提高分化所得肝细胞的效率和成熟度。其次本文采用不同末端基团(氨基、羧基和羟基)和不同大小的五种PAMAM树枝状分子转染hESCs,考察其对hESCs转染能力、生长、干性维持和分化的影响,并动态观察hESCs胞吞胞吐FITC标记的PAMAM的过程。研究发现G5、G7、G4.5COOH和G5OH粒径在5 nm左右,G1直径最小为3.14 nm。G5、G7带正电荷,G1带微弱的负电荷,G4.5COOH和G5OH带较强的负电荷。PAMAM的末端基团对转染、生长分化影响最大,只有末端基团为氨基的PAMAM才能转染hESCs,10μM的G5转染效率最高,低浓度(0.5、1μM)的G7具有一定的转染能力。末端基团为氨基的PAMAM代数越高毒性越大;末端基团为羟基和羧基的PAMAM对hESCs的毒性低,有利于hESCs干性维持。另外,hESCs对FITC标记的G5胞吞胞吐作用明显。综上,对hESCs的转染需要综合考虑末端基团、阳离子大小、电荷等因素才能更好地转染hESCs。