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研究背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,WHO的资料显示,肺癌将成为21世纪对人类威胁最大的肿瘤。肺癌的治疗是一种多学科的综合治疗,其中化疗为治疗的重要手段之一。但目前对晚期NSCLC病人化疗的有效率仅为30-40%,其五年生存率小于15%。肺癌的耐药性是造成化疗失败的重要原因。研究肿瘤细胞的耐药产生机制已成为国内外科学工作者的重要课题。系统地研究肿瘤耐药机制比较复杂,往往是多因素参与、多种机制同时存在的事件,而且不同机制间常相互影响。目前发现p170糖蛋白质、多药耐药相关蛋白质、肺耐药蛋白质、乳腺癌耐药相关蛋白质、拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽S转移酶等多药耐药相关蛋白质与肿瘤多药耐药性相关。发现的与耐药有关的机制可归纳为以下几个方面:细胞膜或胞浆与胞核之间药物摄入和外流的改变使细胞内药物浓度降低;在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变,使药物无法接近其作用靶点;细胞内药物靶酶水平改变或细胞内酶与药物亲和力改变而导致的耐药;肿瘤细胞解毒功能和修复功能增强,促使药物代谢加强而导致的耐药;细胞代谢的变化和肿瘤细胞抗凋亡能力增强等。虽然已有的研究揭示了一些肿瘤的耐药机制,但目前仍然不能完全解释肿瘤耐药现象并有效逆转肿瘤细胞的耐药。蛋白质组学是动态研究一个细胞、组织或有机体中所表达的全部蛋白质的新兴学科,利用蛋白质组学研究的高通量特点,有可能发现新的耐药相关蛋白,为解释耐药机制和有效逆转肿瘤细胞耐药提供线索。为此,本研究以人肺腺癌细胞株A549和耐顺铂细胞株A549/CDDP为研究对象,采用蛋白质组学的技术和方法研究肺癌耐药的分子机制。第一章人肺腺癌A549及A549/CDDP细胞株蛋白质组学分析目的建立A549及A549/CDDP细胞株总蛋白的双向凝胶电泳图谱（2-DE）,分析辨别两组间的差异表达蛋白质点。方法1.常规培养A549及A549/CDDP细胞,用四氮唑蓝比色法（MTT）检测A549/CDDP细胞耐药指数（RI）。2.采用一步抽提法制备A549及A549/CDDP细胞株的总蛋白质,应用双向凝胶电泳技术建立凝胶电泳图谱,胶体考马斯亮蓝染色,Image Scanner扫描仪扫描凝胶。3.PDQuest软件对两株细胞蛋白质的双向电泳图谱进行比较分析。结果1.A549/CDDP对顺铂的耐药指数为7.8。2.获得了分辨率高和重复性好的A549、A549/CDDP细胞总蛋白的2-DE图谱,两组间有15个差异表达的蛋白质点,在A549/CDDP组有8个表达上调,7个表达下调。结论1.人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP耐药性较好。2.获得了分辨率高和重复性好的A549、A549/CDDP细胞总蛋白的2-DE图谱。为下一步的实验奠定了基础。第二章A549、A549/CDDP细胞株差异蛋白的鉴定与验证目的鉴定与验证A549、A549/CDDP细胞株差异表达蛋白质,寻找肺癌顺铂耐药的相关蛋白质。方法采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对差异表达的蛋白质进行分析,获取MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱（PMF）,用Mascot软件查询NCBInr和SWISS-PROT数据库搜索鉴定差异蛋白。并应用细胞免疫化学和RT-PCR验证部分鉴定的蛋白质。结果初步鉴定了13个差异表达蛋白质,多数与肿瘤的生长、浸润、代谢、免疫等相关。这些蛋白质按功能主要可以分为五类,即代谢相关酶,细胞结构相关蛋白质,分子伴侣,与解毒和DAN修复相关蛋白质,以及信号传导相关蛋白质。免疫细胞化学和RT-PCR也显示了丙酮酸激酶M2（Pyruvate kinaseM2,PKM2）、细胞角蛋白18（Cytoskeletal 18,CK18）在两组间存在表达差异。结论1.经质谱分析及生物信息学检索在A549、A549/CDDP细胞株2-DE图谱中表达差异的蛋白质斑点,初步鉴定出13种蛋白质,提示这些蛋白可能与肺腺癌细胞耐药株耐药相关。2.用细胞免疫化学和RT-PCR法对CK18,PKM2进行进一步验证,结果与蛋白质组学一致,说明采用蛋白质组学筛选出来的差异蛋白在A549、A549/CDDP中确实存在,可作为候选的肺癌耐药相关蛋白,并可进一步进行蛋白质功能的研究。第三章SiRNA-PKM2封闭PKM2基因表达与肺癌顺铂耐药的相关性研究目的应用载体介导的RNAi干扰技术抑制PKM2在A549细胞株中的表达,分析PKM2与肺腺癌顺铂耐药的关系,初步探讨PKM2的功能。方法培养A549细胞,设计SiRNA-PKM2,通过阳离子脂质体转染至细胞内。实验分:对照组、空白载体组、SiRNA-neg组、SiRNA-PKM21组、SiRNA-PKM22组。1.分别用免疫细胞化学方法和RT-PCR方法检测SiRNA-PKM2对A549细胞中PKM2表达的影响。2.用SiRNA-PKM2封闭A549细胞后,应用四氮唑蓝比色法（MTT）检测其耐药性的变化。结果1.免疫细胞化学结果显示:SiRNA-PKM21组、SiRNA-PKM22组PKM2的阳性系数与对照组比较,差异有显著性（P＜0.05）,而对照组、空白载体组、SiRNA-neg组之间比较,无显著性差异（P＞0.05）,SiRNA-PKM21组和SiRNA-PKM22组之间比较有显著性差异。RT-PCR方法检测各组细胞PKM2 mRNA的表达,SiRNA-PKM21组、SiRNA-PKM22组PKM2 mRNA的相对表达强度依次为0.3350±0.0370,0.6750±0.0940与对照组、空白载体组、SiRNA-neg组比较,差异有显著性（P＜0.05）,而对照组、空白载体组、SiRNA-neg组之间比较,无显著性差异（P＞0.05）,SiRNA-PKM21组和SiRNA-PKM22组之间比较有显著性差异。2.用SiRNA-PKM2封闭后的A549细胞与亲代细胞比较,IC50分别为84.67μmol/L及55.13μmol/L,较封闭以前的A549细胞分别增加了2.21倍及1.44倍,即耐药性明显增加。结论1.用SiRNA-PKM2成功抑制了A549细胞PKM2的表达,2.进一步证实了PKM2蛋白的降低与人肺腺癌细胞顺铂耐药相关,揭示了顺铂的耐药机制。