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随着社会的发展、环境的改变及生活水平的提高,心脑血管系统疾病的发病率逐年升高,严重地威胁公众的健康。导致心脑血管疾病确切的病理生理学机理尚未明确,目前认为由多种原因引起,并提出了多种假说,其中有代表性的有氧化应激学说、氧化型胆固醇和氧化型低密度脂蛋白学说、细胞因子假说、同型半胱氨酸假说、尿酸假说、内皮细胞微粒假说、血液流变学假说等,近年来越来越多的研究资料证明,氧化应激可能是心脑血管疾病主要的触发因素。高血脂、高血压、高血糖、缺血性损伤等都能够引起氧化应激,导致心脑血管疾病的发生。研究表明,我国传统中药丹参在心脑血管疾病的治疗中有显著地疗效。本研究以中医药基础理论为指导,受中药复方“君臣佐使”配伍思想启发,丹参水溶性有效成分单体采用均匀设计-高通量筛选这一创新的研究模式进行最优配比组合筛选及药效学研究。实验选用原儿茶醛(protocatechuic aldehyde,Y1)、原儿茶酸(protocatechuic acid,Y2)、咖啡酸(caffeic acid,Y4)、丹参素钠(sodium danshensu,Y5)、迷迭香酸(rosmarinic acid,Y3)、丹酚酸A(salvianolic acid A,Y6)、丹酚酸B(salvianolic acid B,Y7)7种丹参水溶性有效成分7个浓度水平进行均匀设计配伍组合,通过清除自由基实验、还原能力实验、H2O2损伤血管内皮细胞模型、血管内皮细胞营养剥夺模型,进行均匀设计高通量药效筛选研究,探寻其配伍规律,并将筛选出的最佳组合样品进一步开展脑缺血再灌注小鼠学习记忆的改善作用及机制研究。1丹参水溶性成分最优配比体外筛选1.1清除DPPH自由基建立抗DPPH氧化活性实验方法,丹参水溶性成分(Y1~Y7)及不同浓度之间(10-3~10-9 mol·L-1)通过均匀设计,得到14种相互作用的配比组合(A1~A14),评价丹参水溶性有效成分配比组合对DPPH自由基清除率的影响。结果显示丹参水溶性成分各个样品抗DPPH氧化活性作用显著,各配伍组合样品抗dpph作用(dpph自由基清除率)最高a11(y1:10-6mol·l-1,y2:10-9mol·l-1,y3:10-9mol·l-1,y4:10-4mol·l-1,y5:10-3mol·l-1y6:10-3mol·l-1,y7:10-6mol·l-1)为(56.9±1.3)%。1.2还原能力测定建立还原能力测定方法,丹参水溶性成分(y1~y7)及不同浓度之间(10-3~10-9mol·l-1)通过均匀设计,得到14种相互作用的配比组合(b1~b14),评价丹参水溶性有效成分配比组合对还原能力的影响。结果显示丹参水溶性成分各个样品还原能力显著,各配伍组合还原能力最高b11(y1:10-6mol·l-1,y2:10-9mol·l-1,y3:10-9mol·l-1,y4:10-4mol·l-1,y5:10-3mol·l-1,y6:10-3mol·l-1,y7:10-6mol·l-1)为(75.3±2.6)%。1.3对h2o2诱导血管内皮细胞损伤的保护作用建立h2o2诱导血管内皮细胞氧化损伤模型。筛选丹参水溶性有效成分(y1~y7)对血管内皮细胞无毒剂量浓度范围。丹参水溶性各成分及不同浓度之间(10-4~10-10mol·l-1)通过均匀设计,得到14种相互作用的组合(c1~c14),评价丹参水溶性有效成分配比组合对h2o2诱导血管内皮细胞损伤的影响。结果显示丹参水溶性成分y2,y4,y5,y7样品对h2o2诱导血管内皮细胞的损伤具有一定的保护作用,最佳配伍组合c2(y1:10-5mol·l-1,y2:10-7mol·l-1,y3:10-4mol·l-1,y4:10-10mol·l-1,y5:10-10mol·l-1,y6:10-7mol·l-1,y7:10-9mol·l-1)样品的细胞存活率为(70.2±4.3)%。1.4对血清剥夺血管内皮细胞损伤的保护作用建立血清剥夺血管内皮细胞损伤模型。筛选丹参水溶性有效成分(y1~y7)对血管内皮细胞无毒剂量浓度剂量范围。丹参水溶性各成分及不同浓度之间(10-4~10-10mol·l-1)通过均匀设计,得到14种相互作用配比的组合(d1~d14),评价丹参水溶性有效成分配比组合对血清剥夺血管内皮细胞损伤的保护作用。结果显示丹参水溶性成分y1,y2,y5,y6,y7样品对血管内皮细胞营养剥夺损伤具有一定的保护作用,最优配比组合样品d4(y1:10-7mol·l-1,y2:10-4mol·l-1,y3:10-4 mol·L-1,Y4:10-9 mol·L-1,Y5:10-10 mol·L-1,Y6:10-10 mol·L-1,Y7:10-7 mol·L-1)的细胞存活率为(76.0±3.2)%。2最优配比组合对脑缺血再灌注小鼠学习记忆的改善作用及机制研究验证体外筛选的丹参水溶性成分最优配比组合(A11,C2,D4)对小鼠脑缺血再灌注损伤学习记忆的改善作用及其机制。采用改进的Himori法暂时性阻断两侧颈总动脉制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用水迷宫实验,观察配伍组合样品对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用,检测小鼠断头耐缺氧存活时间,脑组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,TChE)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。免疫组织化学方法检测小鼠海马神经元凋亡相关天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-asparate protease-3,Capase-3)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的表达。结果显示,配伍组合D4,A11可明显改善小鼠脑缺血再灌注所致的记忆障碍,增强耐缺氧能力,提高脑内SOD,CAT活性,降低AChE活性和MDA含量;与此同时,抑制凋亡蛋白Capase-3表达,上调NGF表达。其中以D4(2.8μmol·L-1)、A11(30μmol·L-1)组作用最为明显(P<0.01),C2各个剂量组效果不显著(P>0.05)。配伍组合D4,A11对脑缺血再灌注损伤小鼠记忆功能有保护作用,其机制可能通过提高清除脑内自由基能力,抑制小鼠神经细胞凋亡,促进神经再生,来减轻脑缺血再灌注引起的脑组织损伤。