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背景及目的白细胞介素33(IL-33)是一种多效的免疫调控细胞因子,IL-33能够活化Th1,Th2,CD8+T,NK和NKT等多种免疫细胞。目前与IL-33相关的疾病研究主要集中在感染性疾病,变态反应性和自身免疫性疾病,心血管疾病等几个方面。而Thl,Th2, CD8+T,NK和NKT等免疫细胞对肿瘤的生长、转移、预后等有重要作用,我们推测IL-33有可能通过调节CD8+T,NK和NKT等免疫细胞进而影响肿瘤的生长、转移、预后等病理过程,研究IL-33对肿瘤免疫的调节有可能为肿瘤免疫治疗提供重要线索,但是,目前尚无IL-33在肿瘤免疫中作用的研究报道,本研究利用IL-33转基因小鼠、黑色素瘤(?)(?)Leiws(?)肺癌转移模型研究IL-33在肿瘤生长和转移中的作用及对免疫细胞的活化及其机制。方法利用尾静脉接种荧光素酶基因标记的黑色素瘤细胞(B16-luc)和Leiws(?)市癌(LLC)瘤液建立小鼠黑素瘤和Leiws(?)市癌肺转移小鼠模型,通过小动物活体成像动态监测,肺部大体解剖和病理学观察,肺部称重和生存期观察,对比分析B16-luc及LLC在IL-33转基因小鼠和同窝阴性小鼠中的肺转移情况。在B16-luc和LLC两种肺转移模型中,利用流式细胞术对比分析IL-33转基因和同窝阴性荷瘤小鼠脾脏和外周血中CD4+T细胞,CD8+T细胞,B细胞,NK细胞和巨噬细胞所占的百分比。在LLC肺转移模型中,利用免疫荧光技术对比分析IL-33转基因和同窝阴性小鼠肺转移灶中CD8+T细胞和NK细胞的浸润情况。利用流式细胞仪分选健康及B16-luc荷瘤小鼠脾脏中的CD8+T细胞和NK细胞后,利用LDH非放射性细胞毒性检测方法对比评价IL-33转基因小鼠和同窝阴性小鼠的CD8+T细胞和NK细胞对B16-luc靶细胞的毒性杀伤作用。使用IL-33重组蛋白体外刺激来源于野生小鼠脾脏的CD8+T细胞和NK细胞,利用LDH非放射性细胞毒性检测方法,检测IL-33重组蛋白刺激组的CD8+T细胞和NK细胞对B16-luc靶细胞的毒性杀伤作用。使用抗CD8/抗asialo GM1抗体删除小鼠体内CD8+T细胞/NK细胞后,在B16-luc肺转移模型中利用小动物活体成像技术,对比分析小鼠体内CD8+T细胞/NK细胞删除前后肿瘤肺转移情况。使用流式细胞仪从B16-1uc荷瘤小鼠脾脏中分选CD8+T细胞和NK细胞,利用western blotting技术检测IL-33转基因小鼠CD8+T细胞和NK细胞中磷酸化的NF-KB以及CD8+T细胞和NK细胞的表面活化标志CD69的表达情况。利用流式细胞仪从野生小鼠脾脏中分选CD8+T细胞和NK细胞,使用IL-33重组蛋白刺激CD8+T细胞和NK细胞,利用western blotting技术检测IL-33重组蛋白刺激组CD8+T细胞和NK细胞中磷酸化的NF-KB以及CD69的表达情况。结果利用上述方法在整体和细胞水平证实：(1)建立了B16-luc黑色素瘤以及Lewis肺癌(LLC)的肺转移小鼠模型。利用这两种模型证实,转基因过表达IL-33能够抑制B16-luc黑色素瘤以及Lewis肺癌(LLC)的肺转移。说明IL-33在体内能够抑制肿瘤的肺转移。(2) IL-33转基因荷瘤小鼠外周血和脾脏中CD8+T细胞和NK细胞的百分比增高CD8+T细胞和NK细胞在肺部肿瘤转移灶中的浸润明显增多。说明IL-33可以促进CD8+T细胞和NK细胞的增殖以及在肿瘤转移灶的浸润。(3)来源于健康及B16-luc荷瘤IL-33转基因小鼠体内CD8+T细胞及NK细胞对B16-luc靶细胞的细胞毒性效应明显增高；体外使用IL-33重组蛋白刺激CD8+T细胞和NK细胞,也能够增强其对肿瘤的毒性杀伤效应。说明IL-33在体内外均可激活CD8+T细胞和NK细胞的抗肿瘤作用。(4)使用抗CD8或抗asialo GM1抗体删除小鼠体内的CD8+T细胞和NK细胞后,IL-33介导的抗肿瘤转移抑制作用明显受到拮抗。从反面证明IL-33的抗肿瘤作用是通过活化CD8+T细胞和NK细胞实现的。(5) IL-33能够在体内外活化CD8+T细胞和NK细胞,使得这两种细胞内的信号分子NF-κB磷酸化水平及表面活化分子CD69表达增高。说明,NF-κB信号通路是IL-33活化CD8+T细胞和NK细胞的重要通路。结论总结以上研究结果首次证实以下结论：(1) IL-33具有明显的抑制肿瘤的生长及肺转移的作用。这种作用是通过促进CD8+T细胞和NK细胞的增殖和活化实现的。(2) IL-33通过NF-κB言号途径促进CD8+T细胞和NK细胞的增殖和活化,并促进其在肿瘤肺转移灶中的浸润。综上,IL-33对肿瘤的转移具有明显的抑制作用,有可能成为抗肿瘤治疗的免疫细胞因子。背景及目的肺腺癌是肺癌中最常见的类型,而肺腺癌的细胞来源及肿瘤进程尚不明确。因此建立一种能够模拟人类肺腺癌发生、发展的小鼠模型对肺腺癌的研究至关重要。近期研究人员利用重组腺病毒载体表达Cre重组酶诱导K-ras G12D在小鼠肺部表达,建立了一种新型的小鼠肺腺癌模型,该小鼠模型可以很好模拟人类肺癌散发性发生的特征,但使用腺病毒载体的诱发方式建模并不稳定,并且使用大量病毒诱发基因突变产生肿瘤为瞬时过程,也不能模拟小鼠体内肿瘤慢性自发的过程。本研究的目的就是利用转基因小鼠杂交的方式建立一种慢性自发性肺部肿瘤的小鼠模型。方法我们首先构建了一种肺脏特异性低表达Cre重组酶的SPC-CRE转基因小鼠,利用SPC-CRE转基因小鼠与LSL K-ras G12D转基因小鼠杂交,获得SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠。对4月龄,5月龄,7月龄,9月龄SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠肺部进行取材,固定并进行常规石蜡切片及HE染色,镜下观察小鼠肺部病理特征。使用micro-CT对7月龄,9月龄SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠肺部肿瘤结节进行检测。结果成功获得了SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠,该小鼠可以利用肺脏特异性低表达的Cre重组酶体内诱导K-ras G12D在肺部的活化。SPC-CRE-Kras双阳性转基因小鼠4月龄肺部出现轻度炎症反应,5月龄开始肺部可见散在腺瘤样的结节,成瘤率为100%(雌6／6,雄6／6),随着月龄增加,小鼠肺腺瘤结节呈增大趋势,病理变化呈进展状态,9月龄时通过micro-CT可以检测到肺部少量散在孤立的肿瘤结节。结论成功建立了一种利用Cre重组酶体内低表达诱导K-ras G12D在小鼠肺部活化的慢性自发性肺部肿瘤模型,该模型从肺部炎症反应到肺腺瘤进展时程较长,为肺癌发生的研究提供了更长的窗口期。