终末期肝病治疗难度大、效果差,肝移植让众多患者看到了一线希望。肝脏移植后排斥反应虽然没有其他器官(如心、肺、胰和肾等)严重,但排斥问题仍然不能避免,是一个需要解决的难题[1]。目前,已经有大量新型免疫抑制药物研制成功,其在临床应用后,使排斥反应的发生得到了很好的控制,但是需要长期乃至终生应用药物,这加重了患者的经济负担,同时可能导致机体的免疫功能低下,进而诱发感染性疾病、或促进肝炎和肿瘤复发。若能诱导受体对移植物的排斥低反应或特异性免疫耐受,将是解决这一难题的最理想的方法。器官移植细胞免疫的基础是受体T细胞对供体抗原的免疫识别、活化和增殖。抗原的识别需要抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)的参与,其中,树突状细胞(dendritic cell,DC)是众多抗原提呈细胞中最重要的,同时,它也是目前发现的唯一的能激活初始型T细胞(naive T cells)的APC,有研究证实其具有激活Treg的作用[1,2]。事实上,较Tr为早,DC就因为在肝移植中被发现具有诱导耐受的作用而被引入移植耐受研究中,研究认为供肝大量存在的DC在移植后迁移入受体诱导了免疫耐受[3]。T细胞在同种异体移植排斥反应中起着核心作用。受体T细胞对供体抗原的识别包括直接识别和间接识别,目前,越来越多的研究证实T细胞间接识别途径在移植物慢性功能丧失的发生机制中起重要的作用。因此,阻断间接识别信号通路,进一步了解其分子生物学发生机制,有可能诱导抑制排斥低反应,甚至诱导移植特异性免疫耐受的发生。在间接识别途径中,抗原呈递细胞表面共刺激分子与T细胞表面的相应受体的结合,使受体T细胞活化,其中,CD80/CD86-CD28是最重要、研究最多的一条共刺激通路。为此,本课题拟采用RNA干扰技术抑制供体树突状细胞表面CD80和CD86的表达,收集体内、体外实验的结果,观察阻断T细胞间接识别通路对大鼠同种异基因肝脏移植的影响,并初步探讨其相关机制。第一部分大鼠树突状细胞体外扩增和鉴定[目的]获取大鼠三种不同成熟状态(imDC、smDC和mDC)的骨髓源树突状细胞。[方法]体外利用rrGM-CSF和rrIL-4诱导大鼠骨髓来源单个核细胞定向分化为树突状细胞(DC)。再分别不加刺激剂、添加TNF-α和LPS诱导DCs分化成未成熟(imDC)、半成熟(smDC)和成熟(mDC)。并对三种成熟状态的树突状细胞进行形态、细胞表型和功能状态(对异基因淋巴细胞和CD4+CD25+Treg细胞的激活能力)的鉴定,确认所获得imDC、smDC和mDC的可靠性。[结果]所得smDC形态介于imDC和mDC之间;其高表达MHC-Ⅱ、中度表达CD80/86等共刺激分子,表型更为接近mDC;smDC与imDC一样,对异基因淋巴细胞无激活能力,而激活CD4+CD25+Treg细胞增殖的能力为三者之中最强。[结论]利用rrGM-CSF和rrIL-4联合诱导,可获得纯度高、功能稳定的imDC、smDC 和 mDC。第二部分RNA干扰阻断不同成熟状态大鼠DC细胞CD80/CD86基因表达的研究[目的]针对大鼠CD80和CD86基因,构建RNAi慢病毒载体,在体外观察其对大鼠不同成熟状态骨髓源性DC细胞表面分子表达的影响。[方法]筛选确定大鼠DC细胞CD80、CD86基因RNAi的有效靶序列,合成慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的大鼠骨髓源性未成熟、半成熟树突状细胞(imDC、smDC),以荧光显微镜检测感染效率,以流式细胞仪检测CD80和CD86的表达变化情况,Western Blot实验检测CD80和CD86基因蛋白质表达水平的变化。[结果]重组质粒shRNA PCR,shRNA的Oligo DNA序列测序结果证实,构建的LV-GFP-shCD80和LV-GFP-shCD86慢病毒载体正确;复感指数MOI为20时,慢病毒imDC和smDC的感染率分别为79.98%±5.01%及81.38%±4.96%,感染效率高。流式检测提示,不论是imDC还是smDC,同时感染LV-GFP-shCD80和LV-GFP-shCD86的DC,在加脂多糖促成熟后,CD80和CD86的表达均比空白对照组DC低,有统计学显著性差异(p<0.01),同时OX62和MHC-Ⅱ的表达未受到影响。Western Blot检测提示慢病毒转染后,imDC和smDC的CD80、CD86基因的蛋白质表达量较阴性对照组显著降低,imDC的蛋白质表达量较smDC更低。[结论]大鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体构建正确,其能明显抑制加脂多糖促成熟后imDC和smDC表面CD80和CD86的表达的增加。第三部分重组慢病毒预处理的供体DC阻断受体T细胞共刺激通路的体外研究[目的]在体外观察重组慢病毒处理DC的免疫反应活性,证实其具有诱导移植免疫耐受的作用,为下一步的体内实验提供理论依据。[方法]分离受体大鼠脾脏T淋巴细胞,行混合淋巴细胞实验,检测重组慢病毒处理的供者DC刺激受者T细胞增殖的能力。预先采用各组DC致敏受体大鼠,取致敏大鼠脾脏T细胞与重组慢病毒预处理的供体DC,行再次混合淋巴细胞实验,检测预致敏的受体T细胞针对供体抗原特异性的免疫活性。同时,流式细胞检测两次混合淋巴细胞反应中,DC诱导受体Treg增殖的能力。[结果]大鼠CD80/CD86基因RNA干扰慢病毒载体处理的供者imDC和smDC,明显抑制了受体T细胞的增殖反应,并且能够诱导产生针对供者抗原的免疫低反应,imDC组的效应比smDC组强。同时可以刺激CD4+CD25+T细胞增殖,smDC的作用强于imDC。[结论]重组慢病毒处理DC在体外有诱导移植免疫耐受的作用。第四部分建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型[目的]建立稳定的大鼠同种异体原位肝移植模型,观察Lewis→BN大鼠肝移植急性排斥反应的特点。[方法]采用改良“二袖套管法”,以SD大鼠进行训练,建立稳定的大鼠同种异体原位肝移植模型,随后,选择Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,分为BN→BN肝移植非干预组、Lewis→BN肝移植非干预组、Lewis→BN肝移植干预组(围手术期短期饲喂治疗剂量的雷帕霉素),观察实验动物术后生存情况及生存时间,检测术后第1d、4d、7d、10d天肝功能、移植肝大体改变及病理改变。[结果].BN→BN组大鼠术后可长期存活,肝功能稳定无明显恶化,全段观察时间内病理切片无明显排斥反应或仅有轻微排斥反应;Lewis→BN非干预组大鼠术后早期死亡,肝功能急剧恶化,病理切片出现迅速而强烈的急性排斥反应;Lewis→→BN干预组大鼠在停药后逐渐死亡,生存期不超过2周,停药前肝功能逐渐恢复,停药后迅速恶化,病理切片有不同程度的排斥反应,停药前排斥反应轻,停药后迅速加重。[结论]Lewis→BN组大鼠肝移植排斥反应明显,可作为ROLT急性排斥模型。雷帕霉素可以有效抑制Lewis→BN组大鼠肝移植排斥反应。第五部分RNA干扰阻断CD80、CD86的不同成熟状态供体树突状细胞在大鼠肝移植模型中致排斥低反应的研究[目的]在建立同种异基因大鼠肝脏移植模型的基础上,探讨重组慢病毒处理的供体树突状细胞在体内诱导移植免疫低反应的可行性及其免疫学机制。[方法]以Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,分为未成熟树突状细胞组、半成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞干扰组、半成熟树突状细胞干扰组。移植术前7天经尾静脉输注各种不同的供体树突状细胞预处理大鼠,行大鼠两袖套原位肝移植。观察肝脏移植大鼠的生存情况及存活时间,检测术后第1d、4d、7d、10d天肝功能变化、外周血细胞因子和Treg细胞增殖的情况、组织病理学改变。[结果]术前输注各种供体DC配合术后使用雷帕霉素,与单纯使用雷帕霉素比较,可以进一步延长受体大鼠术后生存时间,减轻移植术后肝功能损伤,减轻急性排斥反应的程度,停药后(10d)尤其明显。术前输注各种供体DC配合雷帕霉素,可以抑制Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)、促进Th2型细胞因子(IL-2和IL-10)的分泌,诱导肝脏移植受体外周血中Treg细胞的产生。RNA干扰CD80/CD86的DC组上述各种反应优于未经RNA干扰组。[结论]术前输注各种供体DC配合术后使用雷帕霉素可以诱导移植免疫低反应。各种DC与雷帕霉素可能有协同作用。RNA干扰技术阻断共刺激通路确实对移植物产生了保护作用。通过体内外实验,我们证实供体imDC和smDC有诱导受体免疫低反应的能力,若使用RNAi技术阻断DC表面共刺激分子CD80/CD86的表达,则其诱导受体免疫低反应的能力增强,为DC诱导免疫耐受指出了一个研究方向。