【摘 要】
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2-氯烟酸是一种重要的中间体,广泛应用于医药和农药化学品合成。传统化学法合成2-氯烟酸存在原料昂贵、副产物多、反应条件严苛和环境污染大等缺陷,很难满足当下绿色合成的要求。酶催化因其高催化效率、高立体选择性及环境友好等优点,已成为替代化学工业绿色转型升级的重要途径。因此,开发绿色、高效的2-氯烟酸酶法合成具有重要意义。酰胺酶是一类重要的工具酶,可催化酰胺水解合成相应的羧酸。本论文围绕酰胺酶高效合成2
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2-氯烟酸是一种重要的中间体,广泛应用于医药和农药化学品合成。传统化学法合成2-氯烟酸存在原料昂贵、副产物多、反应条件严苛和环境污染大等缺陷,很难满足当下绿色合成的要求。酶催化因其高催化效率、高立体选择性及环境友好等优点,已成为替代化学工业绿色转型升级的重要途径。因此,开发绿色、高效的2-氯烟酸酶法合成具有重要意义。酰胺酶是一类重要的工具酶,可催化酰胺水解合成相应的羧酸。本论文围绕酰胺酶高效合成2-氯烟酸,通过半理性设计改造酰胺酶,对酶催化口袋及底物通道进行结构调控,提高了催化活力和热稳定性,为酰胺酶法合成2-氯烟酸奠定了基础。1)以本实验室前期构建的重组酰胺酶Pa-Ami的突变体G175A为研究对象,通过穿线建模、通道分析和分子对接定位活性中心及底物通道中影响酶催化效率的关键氨基酸位点。利用饱和突变结合高通量筛选,获得5个活力提高的单突变体A378V、A378T、V402L、L403V和L403T,进一步迭代突变后得到17个活力提高的突变体。其中,A378V/V402L/L403V的酶活最高,达到127.44 U·mg-1。考察了A378V/V402L/L403V的酶学性质,发现其最适p H值为8.5,最适温度为55℃,在55℃的半衰期是G175A的1.5倍。进一步考察了A378V/V402L/L403V催化合成2-氯烟酸反应进程,通过底物分批补料,5 g·L-1全细胞催化可合成930m M 2-氯烟酸,2-氯烟酸积累浓度为G175A的1.63倍。2)考察了A378V/V402L/L403V对4种氯代烟酰胺的反应动力学参数,A378V/V402L/L403V对2-氯烟酰胺的活力仅次于4-氯烟酰胺,Vmax为117μmol·mg-1min-1,kcat/Km为124 m M-1·min-1。相较于G175A,A378V/V402L/L403V对2-氯烟酰胺和4-氯烟酰胺的催化效率增加,而5-氯烟酰胺和6-氯烟酰胺催化效率降低。用穿线法构建了A378V/V402L/L403V的结构模型,对其通道分析发现,A378V/V402L/L403V的通道较G175A的瓶颈半径不变,但是通道更短。分析了2个关键的功能区域,通道和催化中心结构上的改变对不同的氯代烟酰胺的影响。2-氯烟酰胺、4-氯烟酰胺和6-氯烟酰胺在通道上的结合能降低,5-氯烟酰胺的结合能升高。在催化口袋中,Ser177的Oγ和酰胺的羰基C原子的距离降低0.2?,并且Ala131与2-氯烟酰胺的吡啶氮原子之间增加了氢键,有助于A378V/V402L/L403V更高效的催化2-氯烟酰胺的水解。3)基于计算机辅助程序DbD 2.0的预测,确定了多个可以引入二硫键的氨基酸位点,突变后进行表达。结合高通量筛选方法筛选得到一个热稳定性提高的突变体S157C/S169C,经DTT法验证二硫键在Ser157和Ser169位点间成功引入。突变体S157C/S169C比酶活为33.4 U·mg-1,对2-氯烟酰胺的Vmax和Km分别为33.3μmol·mg-1min-1和26.19 m M。考察了S157C/S169C的热稳定性,结果表明其在55℃的半衰期为30 min,是G175A的1.8倍,T5030为55℃,较G175A提高了5℃,起始去折叠提高了12℃。
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