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目的:血视网膜屏障(blood retinal barrier BRB)类似于血脑屏障(Blood Brain Barrier BBB),都具有选择通透性。位于视网膜组织和血液之间。对维持视网膜微环境的稳态起着重要作用。大部分视网膜疾病都可以引起BRB的损伤,包括糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞和视网膜脱离等。大量研究表明氧化应激产生过量的活性氧(ROS)会导致细胞的变性和坏死。视网膜血管内皮细胞作为BRB重要组成部分,其ROS的主要来源是4型NADPH氧化酶(NOX4)。所以我们研究NOX4干扰,能否减少ROS的产生,减轻实验性视网膜脱离大鼠BRB的损伤,减少光感受器细胞的坏死,从而保护大鼠视功能。从而为我们视网膜脱离患者视功能的保护提供有效的治疗思路。方法:(1)构建并筛选NOX4干扰重组腺相关病毒2(AAV2)质粒并且包装测定病毒滴度。荧光显微镜下观察AAV2载体转染PC-12细胞系的效率。(2)腺相关病毒载体视网膜下腔注射转染大鼠视网膜,3周后取大鼠视网膜制作冰冻切片,荧光显微镜下观察病毒转染大鼠视网膜情况,每只大鼠右眼做实验组,左眼作为对照组。(3)AAV2载体转染视网膜3周后,采用经典的视网膜下注射透明质酸钠的方法建立视网膜脱离模型,根据不同的处理,分为正常对照组(attached组),未干预组(untreated组),NOX4干预组(sh-Nox4组),阴性干预组(sh-neg组)。建模3天后,取视网膜组织检测,每只大鼠右眼做实验组,左眼作为对照组。(4)采用电镜观察视网膜血管内皮细胞和光感受器细胞的形态学特点,计算光感受器细胞的坏死。(5)采用蛋白免疫印记法(Western Blot)检测出大鼠视网膜NOX4蛋白表达水平。(6)共聚焦显微镜下观察伊文斯蓝灌注的视网膜铺片,观察EB从血管中的渗漏,评估BRB损伤的情况。(7)改良水迷宫实验检测大鼠从水面上平台的时间(逃避潜伏期,escape latency),从而评估大鼠视功能情况。(8)荧光酶标仪检测大鼠视网膜ROS表达强度。结果:(1)构建了三种AAV2载体(NOX4-rat-321、NOX4-rat-578、NOX4-rat-1207),根据对PC-12细胞的转染效率及NOX4的沉默效果,我们选择了转染效率最高而且沉默效果最好的NOX4-rat-1207。病毒滴度为1.12x1013V.G./ml,AAV-NC的病毒滴度为3.99x1010V.G./ml。(2)大鼠视网膜冰冻切片显示,病毒转染3周后,荧光显微镜下使用蓝光和红光观察GFP荧光和DAPI染色。可以观察到大部分视网膜可以被病毒有效的转染,光感受器细胞层检测到较强的GFP荧光表达,余下各层均有表达。(3)造模成功后显微镜下可以看到视网膜隆起明显,未见明显出血及白内障。(4)电镜下发现RD后,sh-Nox4组大鼠相对于untreated组和sh-neg组大鼠的视网膜血管内皮间的紧密连接破坏明显减轻。发现sh-NOX4组光感受器细胞坏死数(15.33±1.65)%明显低于未干预组(untreated组)(22.60±1.51)%和阴性干预组(sh-neg组)(22.99±4.09)%,P<0.01。(5)Western Blot检测结果显示,sh-NOX4组的NOX4蛋白(1.03±0.14)相对表达较正常对照组(attached)(1.41±0.23)、未干预组(untreated组)(1.94±0.36)和阴性干预组(sh-neg组)(1.71±0.18)明显降低。差异有统计学意义(P<O.01)。(6)共聚焦显微镜下发现attached组大鼠视网膜血管结构清晰,充盈良好,粗细均匀,未见EB渗漏。untreated组、sh-NOX4组和sh-neg组大鼠视网膜血管均出现EB渗漏,但相对于untreated组和sh-neg组,sh-NOX4组大鼠的视网膜EB渗漏情况明细减轻。(7)记录大鼠从水面上平台的时间(逃避潜伏期,escape latency),sh-NOX4组大鼠的逃避潜伏期(16.82±5.79s)相对于untreated组(48.54±8.15s)和sh-neg组(45.46±16.00s)明显降低,P<O.01,差异有统计学意义。(8)荧光酶标仪检测ROS的荧光强度,并用荧光强度/毫克蛋白表示视网膜组织ROS强度。结果显示sh-NOX4组(8621.97±1064.57)相对于untreated组(15881.45±1770.43)和sh-neg组(14442.48±949.78)明显降低,P<O.01,差异有统计学意义。结论:NOX4干扰能有效的保护实验性视网膜脱离后血视网膜屏障的破坏,其作用机制可能是NOX4干扰降低实验性视网膜脱离后视网膜血管内皮细胞ROS的产生,从而保护血视网膜屏障,降低光感受器细胞的坏死,保护大鼠视功能。