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嗜水气单胞菌在自然界中分布广泛,由致病性嗜水气单胞菌引起的疾病在世界海、淡水养殖中也普遍存在,给养殖生产带来了巨大损失,如何对其所致的各类疾病进行有效控制一直为研究者所重视。菌蜕是革兰氏阴性菌被噬菌体phiX174的裂解基因E裂解后所形成的不含胞质内含物的完整细菌空壳。由于保留了细菌原有的表面结构和特性,因此是一种比常规疫苗更理想的新型疫苗体系。当前菌蜕疫苗的制备均是通过转化携带有裂解基因E及其控制单元的质粒并诱导其表达而完成,存在潜在抗性基因扩散及由于残存活菌所致的安全问题。为解决以上问题,本研究通过将裂解基因E及其控制单元整合进嗜水气单胞菌染色体的aroA基因内,构建出兼具减毒特性的菌蜕疫苗制备候选突变株,具有更高的安全性。1.嗜水气单胞菌疫苗候选菌株的验证通过形态学观察、选择性培养基筛选、生理生化分析及16SrDNA和gyrB序列测定等方法对本室保存的一株分离自患出血性败血症鲫鱼的细菌J-1进行验证,证明该细菌为嗜水气单胞菌。人工感染实验显示该细菌具有致病性,对异育银鲫的半数致死量为1.2×106CFU。2.基于pR/pL分别启动裂解基因E和核酸酶A基因共表达载体的构建菌蜕是一种新的疫苗平台,它的安全高效生产主要依赖于合适的功能载体。本研究中,我们构建了一系列含phiX裂解基因E和/或核酸酶A的温控质粒并在大肠杆菌中进行了评价。结果表明,核酸酶A的直接产物(pBV220-SNA可以降解质粒及大肠杆菌的基因组,而基因E和部分Cro基因的融合产物(pKF396M-2)则不能裂解宿主菌。通过在两者间插入增强子元件T7g10和SD盒(pKF396M-3)可以恢复基因E的功能。利用基于pR/pL分别启动裂解基因E和核酸酶A基因的共表达载体pKF396M-4,残留质粒及大肠杆菌基因组被清除,灭活效率较单纯使用E介导的裂解质粒要高2个数量级。将基因E和SNA用设计合成的多克隆位点替换即构建成具有两个多克隆位点的双表达载体pKF396M-5。3.嗜水气单胞菌aroA无标记缺失突变株的构建及其特性克隆嗜水气单胞菌J-1株aroA基因及其上下游序列,最终测序拼接出长度为3704bp的核苷酸序列,该序列与嗜水气单胞菌ATCC7966同源性相似度最高,达97%。在此基础上重新设计合成两对引物分别扩增出aroA基因上下游1200bp左右的序列,酶切后连入经多克隆位点置换改造的自杀质粒pDS132,构建出含缺失1103bp aroA基因的重组自杀质粒,将其接合转导至嗜水气单胞菌J-1,通过2次同源重组及PCR鉴定筛选出aroA无抗性标记缺失株,该嗜水气单胞菌aroA缺失株能在LB固体培养基、选择性培养基Rimler-Shoots琼脂上和鉴别性培养基AHM琼脂平板上正常生长,呈现的形态特征也与J-1株类似,但在LB液体培养基中的生长速度则较J-1为慢。在所测试的15项生理生化反应指标中,仅VP反应指标一项与与J-1株不同,为阴性,胞外蛋白酶活性检测呈阳性,对异育银鲫的LD50为2.8×108CFU。4.基于染色体裂解基因E介导的嗜水气单胞菌菌蜕疫苗的制备利用同源重组技术将裂解基因E及其控制单元整合进嗜水气单胞菌染色体的aroA基因内,并通过升温诱导裂解基因E表达成功制备出非质粒依赖性菌蜕疫苗。溶菌动力学试验显示,在诱导后的1h内,其OD600快速上升,但2h后OD600开始持续下降,6h后开始趋于平稳,此时培养物活菌数从诱导前的6.4×107CFU/mL下降至1.7×102CFU/mL,下降了105倍。扫描电镜观察可见绝大部分菌体经诱导后形成菌蜕,跨膜通道位于细胞中央或两端。5.嗜水气单胞菌菌蜕疫苗对异育银鲫的免疫保护于27.2℃～29.8℃水温下,分别用菌蜕疫苗(AHG)、福尔马林全菌灭活疫苗(FKC)和PBS通过腹腔注射免疫异育银鲫,比较其免疫效果。结果显示,AHG免疫组血清凝集指数(1：277.3)高于FKC免疫组(1：170.7)和PBS免疫组(1：9.6),对同源菌也显示出了更高的杀菌活性,但溶菌酶活力与FKC免疫组相当,均为0.089,显著高于空白组的0.032。同源菌攻击试验显示,AHG、FKC和PBS组的存活率分别为90%,65%和15%。这一切表明,AHG疫苗能诱导更为强烈的免疫反应,提高免疫保护能力。