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鲍曼不动杆菌是临床最常见的非发酵革兰阴性菌,广泛存在于医院环境中,已成为引起呼吸机相关性肺炎、血流感染、腹腔感染和术后伤口感染等院内感染的主要病原菌之一,感染致死率高达20%。然而,现有检测方法如传统培养鉴定、质谱分析、PCR扩增以及基因测序等,或耗时长、灵敏度低,或需要特殊仪器设备、检测成本高,因此,亟需研发快速、灵敏、普适的鲍曼不动杆菌检测新方法,而随着生物技术和纳米技术的飞速发展,新型生物传感器的出现,为病原微生物的体外诊断带来了契机。核酸适配体（Aptamer,Apt）是一种功能核酸,可特异性识别蛋白、核酸、药物、代谢小分子以及病原微生物等靶标,具有结合能力强、稳定性高以及易于合成和修饰的优点,已广泛用于构建生物传感器。与此同时,借助纳米材料例如:贵金属材料、磁性材料、金属有机骨架材料以及上转化发光材料等的多功能性、良好的生物相容性以及优越的生物活性（如催化活性、光敏活性以及抗菌活性等）,生物传感器的分析性能得到大幅度提升,使基于核酸适配体和纳米材料的适体传感器（Aptasensor）,在临床病原微生物检测领域的应用前景变得更为广阔。但是,目前用于病原微生物检测的适体传感器仍存在核酸适配体与纳米材料结合不稳定,结合效率低以及检测灵敏度不足等问题。为了解决上述问题,本论文基于核酸适配体、金属有机骨架纳米材料和CRISPR-Cas生物材料的优势,通过探讨Zr-MOF纳米材料和CRISPR-Cas12a生物材料介导的两种信号放大机制,构建新型荧光适体传感器;并以鲍曼不动杆菌为靶标,验证荧光适体传感器在临床重要病原菌检测中的应用价值。具体内容分为三大部分:1 Zr-MOF纳米材料的信号放大机制研究信号放大效率是影响生物传感器检测灵敏度的关键。金属有机骨架（Metal organic frameworks,MOFs）是无机金属离子和有机配体通过配位键组装合成的晶型杂化材料,具有多孔性、结构可调、功能多样和易于修饰的特性。近年来,国内外研究团队基于MOFs纳米材料（如ZIF-8、MIL-101以及PCN-224等）信号放大策略构建的生物传感器,已实现了对多种生物靶标的灵敏检测,但是,锆基MOFs（Zr-MOFs）作为分析化学中常用的MOFs材料之一,在生物标志物检测方面的应用尚处于起步阶段。通过深入挖掘Zr-MOFs的多功能性,我们发现Zr-MOFs中Zr金属离子可与生物分子中的磷酸根特异性结合,故推测当大量的磷酸根离子存在时,磷酸根与Zr-MOFs中的有机配体竞争性结合Zr金属离子,可能引起Zr-MOFs骨架结构的破坏;基于这一推测,在Zr-MOFs中负载信号分子,合成信号探针,利用高浓度磷酸根离子破坏Zr-MOFs的骨架结构,释放信号分子,有望实现信号放大。为验证这一推测,我们首先利用Zr金属离子和NH2-BDC配体的配位效应合成了一种常用的Zr-MOF纳米材料即UIO-66-NH2,并发现经不同浓度的Na2HPO4处理后,UIO-66-NH2的NH2-BDC配体在426 nm波长处的荧光强度发生不同程度的改变,且随着Na2HPO4浓度的升高,NH2-BDC配体的荧光强度进行性增强,提示磷酸根可竞争性结合UIO-66-NH2中Zr金属离子,使UIO-66-NH2释放NH2-BDC配体,且该竞争性结合效应具有浓度依赖性。进一步地利用UIO-66-NH2的多孔性包被有荧光素F（F@UIO-66-NH2）并经1M Na2HPO4（含高浓度磷酸根离子）处理5分钟后,UIO-66-NH2典型的八面体结构和晶型被完全破坏,响应性释放其孔道内负载的荧光素F,导致荧光素F在512nm波长处的荧光强度迅速增强。因此,基于UIO-66-NH2的多孔性及其在Na2HPO4缓冲液中结构的不稳定性,合成Na2HPO4响应性信号探针、构建生物传感信号放大体系,具有充分的可行性。同时,由于F@UIO-66-NH2响应性释放荧光素F的行为具有Na2HPO4浓度依赖性,使该响应性释放体系具有可调节性。在低浓度Na2HPO4作用下,表现为“缓慢释放”,而在高浓度Na2HPO4作用下,表现为“突发释放”。这种特性将为Zr-MOFs在生物传感、生物成像及靶向纳米治疗等研究领域的应用提供重要的理论依据和全新的研究思路。2基于Zr-MOF的荧光适体传感器用于检测鲍曼不动杆菌在证实了UIO-66-NH2信号放大机制的基础上,我们在Fe3O4（磁核）表面原位生长UIO-66-NH2,合成了核-壳结构的新型磁性Zr-MOF纳米材料（Zr-mMOF）,利用UIO-66-NH2的Zr金属位点可通过Zr-O-P共价键牢固结合磷酸根的特性,将磷酸根标记的鲍曼不动杆菌特异性核酸适配体（p-Ab-Apt）高效修饰在Zr-mMOF表面,合成磁性捕获探针Zr-mMOF-p-Ab-Apt,增强了核酸适配体二级结构的稳定性,克服了现有适体传感器存在的核酸适配体与纳米材料结合不牢、效率不高以及在临床样本检测中性能不稳定的缺陷,使得Zr-mMOF-p-Ab-Apt的核酸适配体修饰效率高达93.30%,捕获效率可达84.92%-96.79%且捕获特异性可达93.08%-94.31%,优于免疫修饰法或化学修饰法构建的磁性捕获探针。进一步地用UIO-66-NH2负载荧光素F,并在其表面修饰磷酸根标记的细菌细胞壁脂多糖（LPS）的核酸适配体（p-LPS-Apt）,构建信号探针（F@UIO-66-NH2-p-LPS-Apt）,核酸适配体修饰效率达93.0%。不仅稳定了核酸适配体的二级结构,还使得p-LPS-Apt在UIO-66-NH2表面形成“核酸分子开关”,封闭其内孔道内的荧光素F,避免荧光素F的外溢,降低背景信号。最后,采用双适体夹心策略,将捕获探针和信号探针先后与鲍曼不动杆菌共孵育后,利用1M Na2HPO4溶液破坏捕获探针/细菌/信号探针复合物中UIO-66-NH2的晶体结构,响应性释放荧光素F,实现信号放大,成功构建新型荧光适体传感器。该荧光适体传感器可在2.5小时内完成血液标本中鲍曼不动杆菌的检测,线性范围为101-105 CFU/mL,最低检测限为10 CFU/mL。本研究在证明UIO-66-NH2信号放大机制的基础上,深入挖掘Zr-MOF（UIO-66-NH2）的多功能性,创新性地探索了Zr-MOF同时作为捕获探针和信号探针的可行性及其机制。而且,通过改变探针中核酸适配体的序列,可实现对不同病原微生物如细菌、病毒、真菌等的快速、灵敏、特异地富集和检测。由此可见,本部分构建的荧光适体传感器具有通用性,在临床病原微生物的体外诊断中具有潜在应用价值。3基于CRISPR-Cas12a的荧光适体传感器检测鲍曼不动杆菌在感染初期,患者体内鲍曼不动杆菌的细菌载量较低,尤其是在血流感染初期,血液中鲍曼不动杆菌的细菌载量往往低于10 CFU/mL,而上述基于Zr-MOF和核酸适配体构建的荧光适体传感器的检测限为10-100 CFU/mL。同时,由于微米级的细菌和纳米级的MOF材料之间可能存在空间位阻效应,限制了双适体纳米探针与细菌的结合,影响检测灵敏度。因此,我们进一步利用比细菌和纳米材料体积小的蛋白或核酸等生物活性分子,减少潜在的空间位阻效应,建立更为高效的信号放大体系,以期提高荧光适体传感器的灵敏度。CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌的生物免疫防御机制,而随着LbaCas12a核酸酶的特异性靶向和顺、反式切割核酸的特性被先后报道,国内外研究团队陆续利用LbaCas12a核酸酶的这两大特性成功构建DETECTR、HOLMES等CRISPR-Cas12a分子诊断技术,实现了对核酸以及单核苷酸多态性的单分子检测。但是,CRISPR-Cas12a技术在非核酸类生物靶标检测中的应用价值尚不清楚,且该系统与核酸适配体、纳米材料的整合应用价值尚不明确。因此,我们进一步探讨了核酸适配体、功能纳米磁珠和CRISPR-Cas12a系统在临床病原微生物单分子检测中的整合应用价值。首先,采用生物素-链霉亲和素的非共价结合方式,将生物素修饰的鲍曼不动杆菌特异性适配体（Ab-Apt-biotin）连接在链霉亲和素功能化的磁珠（MB）表面,随后将互补序列c-Ab-Apt通过碱基互补配对结合在Ab-Apt-biotin上,合成捕获探针DNA activator@MB;同时,以c-Ab-Apt为靶标,设计CRISPR-Cas12a荧光信号放大体系;最后,利用核酸适配体竞争性触发策略,构建新型荧光适体传感器。该荧光适体传感器可在1.5小时内完成鲍曼不动杆菌检测,线性范围为101-105 CFU/mL,最低检测限为3 CFU/mL,初步实现了单分子检测,显著提高了方法的检测灵敏度。同时,在临床血清中加入0.1 Unit/mL的RNase抑制剂后,该方法检测血清样本中鲍曼不动杆菌的相对荧光信号仍可达到87%,提示该方法在鲍曼不动杆菌感染早期诊断中具有潜在的应用价值。本研究创新性地将磁性适体探针对临床病原菌的检测信号成功转化为核酸信号,触发CRISPR-Cas12a信号放大体系,实现对临床病原菌的单分子检测,为CRISPR-Cas12a在非核酸生物靶标检测中的应用提供了新的研究策略。