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动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)是危害人们健康的常见病,是导致多种心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases,CCVD)的重要因素,近年来发病率呈上升趋势,研究发现斑块破裂是导致CCVD临床终点事件发生的主要原因,血脂代谢异常、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的增殖与凋亡、促凋亡基因caspase-3和抑制凋亡基因bcl-2以及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要降解酶——基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及其基质金属蛋白酶抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)与AS斑块的易损性有着密切的关系。而中医认为热毒、湿热、瘀血、痰浊、机体自身的亏虚或者这几种病机的相互作用是导致AS发生的主要机制,使用的清热解毒、清热化湿、活血化瘀、化痰通络以及培补机体气血脏腑亏虚等方法干预研究AS,已经取得了很大的成就,但对于AS斑块易损性的中医研究相对较少。少数专家认为,导致AS斑块易损性的炎症机制和中医的热毒关系密切,并做了些研究,取得了一定的成绩。通过补肾活血化痰的方法治疗AS,是广州中医药大学罗陆一教授多年从事心脑血管疾病的临床与实验研究的经验总结,对AS疾病的治疗有着很好的疗效,实验研究也取得了些进展,但始终未曾涉及对AS斑块易损性的研究,因此本课题以此为出发点,使用具有补肾活血化痰作用的补肾活血化痰方对AS斑块易损性的影响进行研究。本课题以AS斑块易损性为切入点,从临床研究和实验研究着手,研究补肾活血化痰方阻碍和延缓AS的进程、稳定AS斑块的机制。1临床研究1.1补肾活血化痰方对颈动脉粥样硬化病人影响的研究目的:通过观察补肾活血化痰方对颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis,CAS)病人症候积分、总体疗效、血脂、颈动脉内中膜厚度(intima-media thickness,IMT)及颈动脉内斑块的影响,研究补肾活血化痰方对改善CAS患者症状、提高总体疗效、对AS发生发展以及AS斑块易损性影响的机制。方法:选择CAS病人96例,随机分为2组,补肾活血化痰方组(Treatment groupof Bushenhuoxuehuotan decoction,BSTG)和阿托伐他汀组(Treatment group ofatorvastatin calcium,ACTG)各48例,分别用补肾活血化痰方和阿托伐他汀进行干预6个月,通过症候积分评价患者症状改善情况并对总体疗效进行评价,用全自动生化分析仪检测CAS病人血脂,多普勒超声检测颈动脉IMT及颈动脉内斑块的类型、数量,数值用均数±标准差((?)±S)表示,使用SPSS11.5统计软件进行统计分析,组间比较用独立样本t检验,组内治疗前后比较用配对样本t检验,等级资料用Ridit分析,率的比较用卡方检验。结果:与治疗前比较:两组症候积分均明显降低(P＜0.01或P＜0.05),两组之间无显著差别,两组总体疗效均显著,BSTG组总体疗效明显优于ACTG组;治疗后两组TC、LDL-C水平较治疗前明显下降(P＜0.01或P＜0.05),HDL水平明显升高(P＜0.05);BSTG对GAS患者TG无明显作用(P＞0.05),但ACTG组血清TG水平较治疗前明显降低(P＜0.05);在升高HDL和降低TC方面两组无显著差别(P＞0.05),但治疗后ACTG血清LDL-C水平较BSTG显著降低(P＜0.05);治疗后两组组的IMT较治疗前明显变薄(P＜0.01),斑块个数明显减少(P＜0.01),两组比较无显著差别(P＞0.05)。结论:补肾活血化痰方可以明显改善CAS患者症状,总体疗效显著,可以有效降低CAS的TC、LDL-C和升高HDL,但可以使颈动脉的IMT明显变薄、可以使斑块数量减少,因此补肾活血化痰方有阻碍或延缓CAS斑块进展并稳定斑块的作用,对血脂的调节可能是机制之一。1.2补肾活血化痰方对冠状动脉粥样硬化病人影响的研究目的:观察补肾活血化痰方对冠状动脉粥样硬化(coronary atherosclerotic heartdisease.CAD)病人血清血脂、MMP-2和TIMP-2的影响,研究补肾活血化痰方对AS发生发展以及斑块易损性影响的机制。方法:选择CAD病人75例,随机分为2组,BSTG组25例和ACTG组50例,分别用补肾活血化痰方和阿托伐他汀进行干预,3个月后,ACCA检测两组病人各项血清血脂水平,酶联免疫法(ELISA)检测血清MMP-2和TIMP-2水平数值用均数±标准差((?)±s)表示,使用SPSS11.5统计软件进行统计分析,组间比较用独立样本t检验,组内治疗前后比较用配对样本t检验。结果:与治疗前相比:两组治疗后的血清TC、LDL-C水平较治疗前明显下降(P＜0.01),BSTG组HDL-C水平明显升高(P＜0.01),而ACTG组TG、HDL-C水平无明显变化;两组TC无显著差别(P＞0.05),BSTG较ACTG的HDL-C显著升高(P＜0.01)、TG显著降低(P＜0.05),ACTG较BSTG组LDL-C显著降低(P＜0.05);治疗后两组血清MMP-2和TIMP-2水平较治疗前明显下降(P＜0.01),两组间比较无显著差别(P＞0.05)。结论:补肾活血化痰方可以显著降低CAD病人血清TC、TG、LDL-C,升高HDL-C水平,并使CAD病人血清MMP-2和TIMP-2协调平衡,推断补肾活血化痰方可以有效阻碍和延缓CAD病人AS斑块进展并稳定AS斑块,对血脂和MMP-2和TIMP-2协调平衡的调节可能是补肾活血化痰方抗AS的机制之一。二、实验研究补肾活血化痰方对兔AS模型斑块易损性的影响目的:通过对兔AS模型斑块易损性相关指标α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscleactin,α-SMA),增殖细胞核抗原(Proliferating cell nu clear antigen,PCNA),血管平滑肌细胞凋亡(vSMC apoptosis,VSMCAP),bcl-2,caSpaLse-3,MMP-2 and TIMP-2的检测,探讨导致AS斑块易损的机制,研究补肾活血化痰方对AS斑块易损性的影响及其稳定AS斑块的机制。方法:选取健康新西兰雄性大耳白兔60只,随机分成6组,空白对照组(controlgroup,CG),模型组(model group,MG),补肾活血化痰方干预组(intervention group ofbushenhuoxuehuotan deconction,BSIG),阿托伐他汀干预组(intervention group ofatorvastatin calcium,ACIG)补肾活血化痰方治疗组,(treatment group ofbushenhuoxuehuotan deconction,BSTG),阿托伐他汀治疗组(Treatment group 0fatorvastatin calcium,ACTG),每组10只,后面5组为造模组;通过高脂饲料喂养及牛血清白蛋白耳缘静脉注射制作动脉粥样硬化模型,CG组给以普通饲料喂养,MG组只造模不干预,BSIG组和ACIG组从开始造模时分别给以补肾活血化痰方汤和阿托伐他汀灌胃至CG组模型成功,约12周后取材,BSTG组和ASTG组从造模成功时开始分别给以补肾活血化痰方汤和阿托伐他汀灌胃4周取材;各组在干预结束后,全自动生化分析仪检测6组动物血清血脂水平,免疫组化法检测斑块内α-SMA以标记VSMC、检测PCNA以推测VSMC增殖情况、并检测bcl-2、caspaLse-3、MMP-2和TIMP-2在斑块内的表达,TUNEL法检测斑块内VSMC凋亡数量;计算PCNA表达和VSMC凋亡的阳性细胞数,a-SMA、bcl-2、caSpaSe-3、MMP-2和TIMP-2的表达的阳性细胞面积,数值用均数±标准差表示((?)±S),使用SPSS11.5进行统计分析,组间比较用方差分析,用相关分析和线性回归分析各指标之间关系。结果:(1)血脂:与CG比较,各造模组的各项血脂水平均显著升高(P＜0.001);与MG比较,BSIG和ACIG血清TC、TG和LDL-C水平明显降低(P＜0.01)、HDL-C水平明显升高(P＜0.01),BSTG和ACTG血清TC和LDL-C水平明显降低(P＜0.01),HDL-C水平明显升高(P＜0.01),TG无显著差别;BSIG较ACIG血清LDL-C水平显著降低(P＜0.05),而ACIG较BSIG的TC水平显著降低(P＜0.05),在HDL-C和TG方面无差异(P＞0.05);ACTG较BSTG血清TC水平显著降低(P＜0.05),BSTG较ACTG血清TG水平显著降低(P＜0.05)、HDL-C显著升高(P＜0.01),在LDL-C方面无差异(P＞0.05)。(2)α-SMA、PCNA在斑块内的表达以及斑块内VSMC凋亡的检测结果:与CG组比较,5个造模组α-SMA、PCNA和VSMC凋亡在斑块内的表达均有显著升高(P＜0.001);与MG组比较,BSIG组、ACIG组和ACTG组α-SMA、PCNA和VSMC凋亡在斑块内的表达均有显著降低(P＜0.001),BSTG组α-SMA和VSMC凋亡的表达均有显著降低(P＜0.001),但PCNA无显著差异(P＞0.05);BSIG较ACIG组α-SMA、PCNA和VSMC凋亡的表达无明显区别;BSTG较ACTG组的α-SMA和VSMC凋亡明显升高(P＜0.05),但是PCNA无明显差异。(3)caspase-3和bcl-2在斑块内表达的检测结果与CG组比较,MG组、BSIG组、ACIG组、BSTG组和ACTG组caspase-3表达显著升高、bcl-2表达有显著降低(P＜0.001);与MG组比较,BSIG、ACIG、BSTG和ACTG组caspsae-3表达有显著降低,bcl-2表达有显著升高(P＜0.001);BSIG与ACIG组比较、以及BSTG和ACTG组比较caspsae-3和bcl-2表达无明显差别(P＞0.05)。(4)MMP-2和TIMP-2在斑块内表达的检测结果与CG组比较,MG组、BSIG组、ACIG组、BSTG组和ACTG组MMP-2和TIMP-2表达均有显著升高(P＜0.001);与MG组比较,BSIG组、ACIG组、BSTG组和ACTG组MMP-2和TIMP-2表达均有显著降低(P＜0.001,P＜0.01),BSIG组与ACIG组、以及ACIG组与BSTG组MMP-2和TIMP-2表达无明显区别(P＞0.05)。结论:(1)使用新西兰雄性大白兔,通过高脂饲料加牛血清白蛋白耳缘静脉注射可以成功复制AS兔模型,说明高脂饮食是AS发生发展的重要危险因素,通过对血脂水平的调节,可以阻碍或延缓AS进展,降低AS斑块易损性;(2)使用补肾活血化痰方对AS兔模型进行干预,可以调节各项血脂水平,并且对于LDL-C的早期干预和对HDL-C、TG的后期治疗作用都优于阿托伐他汀;(3)α-SMA、PCNA、bcl-2、caspase-3、MMP-2、TIMP-2和VSMC凋亡之间,多存在着相关性并相互影响。(4)使用补肾活血化痰方对AS进行早期干预和后期治疗,可以有效调节与斑块易损性相关的因子:α-SMA、PCNA、bcl-2、caspase-3、MMP-2和TIMP-2在AS斑块中的表达、控制VSMC凋亡。(5)补肾活血化痰方可以多靶点的作用于AS,即通过调节血脂水平、控制VSMC的过度增殖与凋亡以及阻止ECM降解等机制,延缓和阻止AS进展,降低AS斑块的易损性,并且早期干预的效果优于后期治疗。(6)中医的肾虚血瘀痰阻这种病机与AS进展及其AS斑块易损性之间存在一定的相关性,肾虚血瘀痰阻可能是AS发生发展的病机之一。