骨肉瘤是青少年、儿童最常见的骨的恶性肿瘤,严重影响人们的健康,给家庭以及社会带了巨大的负担。骨肉瘤恶性程度极高,预后极差,通常在短时间内就会出现其他部位的转移,如肺转移,最终导致患者死亡。骨肉瘤患者在早期表现为间歇性疼痛,随着疾病的发展,性质变现为持续性、普通药物不可抑制的疼痛,影响患者的基本生活;病患部位骨质破坏使患者容易发生病理性骨折,骨折难以愈合,会导致患者病患部位的畸形,肿瘤间室的完整性破坏,造成肿瘤细胞的局部播散,使保肢手术变得困难,并影响患者的生存率。骨肉瘤的治疗主要是手术以及新辅助化疗。手术主要的方式是广泛切除瘤段骨,然后进行肢体重建,部分患者甚至需要截肢,术后还要配合化疗防止肿瘤复发和转移,并且手术治疗会影响患者正常的生理功能,影响患者的肢体健全,影响患者的社会功能,降低患者的生存质量,给社会及患者的家庭带来巨大的经济及思想负担,并且术后极易复发,治愈率更低。多疗程的联合化疗容易导致化疗药物的多药耐药性的产生,影响化疗效果,最终影响肿瘤患者的生存率,而且化疗往往具有巨大伤亡毒副作用,可能会损害患者的肝脏、肾脏、心脏功能,甚至破坏患者的免疫系统,花费巨大,疗程之长难以确定,甚至会加速患者的死亡。因此,现在迫切需要寻找一种安全、无痛苦的,高效的治疗方式,用以治疗骨肉瘤。硒作为人体必需的元素,可预防和治疗人40多种疾病,特别是最近几年硒以及含硒化合物在肿瘤的治疗中表现出了优于传统化疗药物的特点,越来越受到大家的重视。硒及含硒化合对肿瘤的抑制作用主要表现在:对肿瘤细胞增殖的抑制作用;对肿瘤细胞迁移的抑制;通过各种途径促进肿瘤细胞的凋亡;促进肿瘤组织中内皮细胞的凋亡,抑制血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、胎盘生长因子（PLGF）和血小板衍生的内皮生长因子（PDEGF）等的生成,减少肿块中新生血管的生成,减少肿块的营养供应,最终达到“饿死”肿瘤细胞的目的。众所周知,肿瘤血管的生成是肿瘤生长、迁移和转移的物质基础,抑制肿瘤血管生成是抑制肿瘤生长的一种有效的手段。所以目前众多的化疗药物大多都是通过抑制肿瘤血管的生成达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的。研究表明:硒及含硒化合物能通过抑制肿瘤血管形成来抑制肿瘤生长和转移。肿瘤的转移和生长,依赖于肿瘤自身建立新生血管网络,硒及含硒化合物可以抑制这种新生血管网的建立,切断肿瘤细胞的氧气和养料传输,肿瘤会因为得不到氧气和养料而“饿死”;同时代谢废物不能排出,肿瘤细胞会趋于坏死和凋亡。硒及含硒化合物对血管生成的抑制主要是影响肿瘤细胞、内皮细胞以及利于血管生成的几个关键因子。在多种肿瘤细胞系中,硒以及含硒化合物可以抑制内皮细胞的生成,使其凋亡,直接破坏肿瘤组织血管形成的结构基础;同时,硒及含硒化合物可以抑制内皮细胞中VEGF（一种血管生成因子）的表达;抑制金属蛋白酶（MMP）,特别是MMP-2的产生,从而抑制基底膜的降解;抑制内皮细胞特异性整合素/生存信号,以达到抑制血管生成的目的。硒代胱氨酸（Selenocysteine,SeC）是天然可获取的含硒氨基酸,己经被证实体内外表现出良好的抗肿瘤活性,可以在体内外通过启动氧化应激损伤,诱导肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡,从而有效抑制恶性肿瘤的生长,是潜在的抗肿瘤药物。研究SeC对恶性肿瘤的生长抑制效果和机制具有重要的研究意义和临床价值。然而,SeC对人恶性成骨肉瘤生长的影响至今没有人报道过,机制也不清楚。本论文拟体外培养人成骨肉瘤细胞系MG-63,体外评价SeC抑制MG-63生长的效果和分子机制;体外评价SeC抑制MG-63迁移、侵袭和血管生成的效果和分子机制;体内构建裸鼠荷瘤模型,评价SeC在体内通过抑制血管生成而抑制骨肉瘤生长的效果和机制。通过本项目的研究将为含硒化合物发展成为抗肿瘤药物提供实验依据。目的1.研究SeC诱导骨肉瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡的效果和分子机制。2.研究SeC抑制骨肉瘤迁移、侵袭和血管生成的效果和分子机制。方法体外培养人骨肉瘤细胞MG-63以及人脐静脉内皮细胞HUVECs。随机分为对照组和SeC给药组。相差显微镜观察各处理组细胞形态及密度的变化;MTT染色法检测细胞活性改变;PI染色后用流式检测细胞周期;JC-1探针检测细胞内线粒体的功能障碍;Mito-traker检测线粒体结构的变化;DCFH-DA检测细胞内ROS的累积;Mito-SOX检测细胞内超氧化物的改变;细胞划痕（伤口愈合）实验检测药物影响下细胞迁移能力;体外侵袭实验检测药物处理下细胞侵袭能力;体外血管生成实验检测给药后对骨肉瘤血管生成能力的影响;Western blotting方法检测细胞周期、凋亡等相关细胞通路蛋白的改变;裸鼠异种移植检测SeC在体内对骨肉瘤细胞抑制的分子机制。结果1.相差显微镜观察:SeC给药组与对照组相比,MG-63细胞形态表现出明显凋亡特征,细胞皱缩,数目显著减少;MTT结果显示:与正常细胞相比,SeC给药组细胞活性显著降低,表明SeC对骨肉瘤细胞具有生长抑制作用,差异具有统计学意义（P<0.05）;流式细胞仪检测结果显示:SeC处理诱导了 S期阻滞和细胞凋亡,出现了明显的Sub-GI峰和S期停滞;DCFH-DA染色表明:SeC剂量和时间依赖性地诱导细胞内ROS的积累;Mito-SOX检测:SeC可以引起细胞内显著的超氧化物阴离子的产生;JC-1探针检测:SeC可以引起线粒体膜电位（△ψm）时间依赖性的降低;Mito-tracker探针结果显示:SeC可以引起线粒体的断裂（丝状变为点状）;MG-63肿瘤异种移植模型结果表明:SeC可显著抑制肿瘤重量和肿瘤体积,对小鼠的体重没有显著影响,体内机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡和Ser15-p53磷酸化;免疫组化结果显示:SeC体内给药可以显着抑制体内肿瘤细胞的增殖（Ki-67染色）,并抑制肿瘤血管生成（CD34染色）;Western blotting结果表明:SeC处理MG-63细胞可剂量依赖性地诱导PARP切割和caspase-3、caspase-7和caspase-9的活化,抑制S期调控蛋白Cyclin A和CDK-2的表达,促进Bad和Bax表达,抑制Bcl-2和Bcl-XL的表达；SeC处理还显著激活了 DNA损伤,表现为ROS相关的p53磷酸化表达上调,具体的磷酸化位点有 Ser 1 5,Ser 20 和 Ser 392。2.划痕（伤口愈合）实验和transwell体外侵袭实验发现VEGF处理可显着促进HUVEC细胞的迁移和侵袭,进而促进血管生成。然而,SeC处理细胞后,可有效地抑制了 HUVEC细胞的迁移和侵袭,进而抑制血管的生成;Western blotting结果表明:SeC可时间和剂量依赖性的抑制P-FAK的表达;FAK的抑制剂PF562271的增加了SeC对HUVEC的抑制,表明SeC抑制HUVEC细胞的迁移是FAK依赖性的;进一步的研究结果表明:SeC抑制了 VEGF-VEGFR2-AKT信号轴的表达,表现在VEGF、P-VERGR2和P-AKT磷酸化抑制;MTT结果表明:LY294002（AKT上游抑制剂）预处理可显著增加SeC对HUVEC细胞的生长抑制,表明SeC抑制HUVECs的生长是AKT依赖性的；骨肉瘤的裸鼠模型结果表明:SeC给药可显著抑制FAK和AKT磷酸化。免疫组化染色显示:SeC处理显着抑制VEGF的表达;HE染色结果表明:SeC给药体内显著抑制血管生成,表现为含有血红细胞的血管数量减少。结论1.SeC通过诱导线粒体功能障碍,活性氧自由基产生,导致DNA损伤,激活p53的磷酸化,启动MG-63细胞S期阻滞和细胞凋亡,进而在体内外有效抑制MG-63恶性骨肉瘤细胞的生长。2.SeC可通过抑制VEGF-VEGFR2-AKT/FAK信号轴的表达,抑制细胞的迁移、侵袭、血管生成,进而在体内外有效抑制恶性骨肉瘤的生长。