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研究背景和目的三阴乳腺癌是乳腺癌的特殊的分子类型,其特点为肿瘤中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)均不表达,因缺乏有效的治疗靶点,三阴乳腺癌患者的预后很差。在最近的研究中发现,肿瘤干细胞在三阴乳腺癌的发生和转移中发挥着关键的作用[1,2]。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是存在于肿瘤细胞中的一种特殊的亚群细胞,肿瘤干细胞数量稀少,并且具有自我更新以及多向分化的能力,研究证实肿瘤干细胞在肿瘤的形成和发展中发挥着重要作用,并影响患者的预后[3-5]。越来越多的证据表明,肿瘤干细胞与肿瘤上皮间充质转化的发生和血管生成拟态的形成存在密切的联系[6]。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是机体正常胚胎发育及肿瘤转移中重要的过程;肿瘤血管拟态(vasculogenic mimicry,VM)是近年发现的特殊肿瘤血液微循环模式,VM不依赖内皮细胞,其管腔由肿瘤细胞围成,并可以在管腔中发现红细胞,VM和肿瘤的恶性程度以及转移具有紧密的联系。在本课题中我们通过研究肿瘤干细胞在三阴乳腺癌EMT的发生及VM形成中的机制,从而为三阴乳腺癌的治疗寻找新的思路。研究方法一、研究人三阴乳腺癌中肿瘤干细胞同VM的关系。收集天津医科大学医院总医院经手术切除并且随访资料完整的100例乳腺浸润性导管癌病理资料100例,以肿瘤干细胞表面标记物CD44、CD24、VM相关蛋白VE-cadherin为指标,对乳腺癌病理组织切片行免疫组织化学染色,并进行CD31/PAS双重染色,观察并分析含有肿瘤干细胞特异性指标CD44+和CD24—表型的乳腺癌干细胞和患者年龄、肿瘤分级、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤转移状况、预后、是否为三阴乳腺癌、VE-cadherin蛋白表达以及和VM的相关性。二、肿瘤干细胞对三阴乳腺癌EMT发生和VM形成影响的体外研究1)常规培养三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231和非三阴乳腺癌细胞系MCF-7,检测MDA-MB-231和MCF-7在管道结构形成能力、迁移和侵袭能力的差异,使用westernblot实验检测其EMT相关蛋白表达的差异;运用流式细胞术分析MDA-MB-231和MCF-7细胞中肿瘤干细胞标记物ALDH1+和CD133+表型细胞的含量,并在MDA-MB-231细胞中分选出带有ALDH1+及ALDH1-表型的细胞。下文分别将ALDH1+表型的MDA-MB-231细胞和ALDH1-表型的MDA-MB-231简称为ALDH1+231和ALDH1-231。2)将分选出的ALDH1+231和ALDH1-231细胞进行低吸附无血清成球培养,观察ALDH1+231和ALDH1-231细胞体外成球能力的差异。3)利用迁移和侵袭实验观察ALDH1+231及ALDH1-231细胞的迁移和侵袭能力的差异。4)利用三维培养分析ALDH1+231及ALDH1-231细胞管道结构形成能力的差异。5)利用Western blot检测ALDH1+231及ALDH1-231细胞中ALDH1的表达和EMT相关蛋白Twist1,E-cadherin,VM相关蛋白VE-cadherin的表达差异。三、TA2小鼠高转移乳腺癌中肿瘤干细胞对EMT发生、VM形成及生物学行为的影响1)选取天津医科大学动物房培育的自发三阴乳腺癌TA2小鼠高转移乳腺癌组织,将肿瘤组织研磨成单细胞悬液,使用流式细胞术分析肿瘤组织中具有肿瘤干细胞特异性分子标记物ALDH+和CD133+的肿瘤干细胞含量。2)在本部分实验中,使用ALDH1作为肿瘤干细胞标记物分选后的乳腺癌细胞记为ALDH1+细胞和ALDH1-细胞,使用CD133作为肿瘤干细胞标记物分选后的乳腺癌细胞记为CD133+细胞和CD133-细胞。分别将分选后的ALDH1+及ALDH1-、CD133+及CD133-共4组肿瘤细胞按照不同细胞量接种于TA2小鼠,观察肿瘤干细胞对TA2小鼠乳腺癌生物学行为的影响。3)将TA2小鼠肿瘤组织制成组织切片,进行ALDH1、CD133、VE-cadherin、E-cadherin、Twsit1和endomucin/PAS双重染色,观察肿瘤干细胞对EMT相关蛋白E-cadherin、Twsit1、VM形成相关蛋白VE-cadherin的影响以及对VM形成的作用。研究结果一、在三阴乳腺癌中CD44表达高于非三阴乳腺癌,CD44阳性患者预后较差,CD44表达与VE-cadherin表达以及VM呈正相关,CD24表达与VM呈负相关。免疫组化结果显示:在100例乳腺癌病例中,包括CD44阳性病例56例(56%),CD44阴性病例44例(44%),在三阴乳腺癌组织中CD44表达高于非三阴乳腺癌患者(c2=5.884,P=0.016),VM阳性患者中CD44表达明显升高(c2=3.89,P=0.049)。通过对TNM分期比较,在Ⅲ、Ⅳ期病人的癌组织中CD44表达比Ⅰ,Ⅱ期病人要高(c2=3.89,P=0.049),VEcaderin免疫组化结果显示,CD44阳性表达的病例中,VE-cadherin要高于CD44阴性表达病例(c2=4.127,P=0.042)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,CD44阳性患者组比CD44阴性患者组的生存时间短(c2=4.307,P=0.038)。CD44的表达在患者年龄、分级、肿瘤大小、以及是否发生淋巴结转移的差异中没有统计学意义(P>0.05)。CD24阳性病例占66例(66%),阴性病例占34例(34%),对比CD24阳性和CD24阴性病例发现,VM与CD24表达呈现负相关(c2=4.397,P=0.036),其他相关数据没有统计学意义。二、三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231乳腺癌干细胞含量高于非三阴乳腺癌细胞系MCF-7中的含量。ALDH1+231细胞在体外成球能力、侵袭和迁移能力、形成管道的能力均高于ALDH1-231的细胞,并且细胞中EMT相关蛋白表达较高。1)三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外形成管道、迁移、侵袭能力以及EMT相关蛋白的表达高于非三阴乳腺癌细胞MCF-7。2)流式细胞术分选结果证实,在MDA-MB-231中ALDH1+表型细胞的表达占26.87%,CD133+表型细胞占8.75%。MCF-7细胞系中ALDH1+表型细胞占3.4%,CD133+表型细胞占1.27%。3)迁移和侵袭实验中发现,与ALDH1-231细胞相比,ALDH1+231的细胞侵袭和迁移能力明显增强。4)三维培养结果显示,ALDH1+231细胞的管状结构形成能力明显强于ALDH1-231细胞。5)Westernblot结果显示,ALDH1+231细胞的VE-cadherin蛋白,Twist1蛋白表达高于ALDH1-231组,E-cadherin蛋白表达低于ALDH1-231组。三、TA2高转移三阴乳腺癌组织中存在肿瘤干细胞,ALDH1+和CD133+表型的肿瘤干细胞具有较强的肿瘤生长能力,并影响EMT相关蛋白的表达并促进VM的形成。1)在TA2高转移乳腺癌组织中ALDH1+细胞占31.2%,CD133+细胞占6.5%。2)ALDH1+组小鼠的肿瘤生长速度明显高于ALDH1-组小鼠。CD133+组小鼠肿瘤生长速度明显高于CD133-组小鼠。3)免疫组化染色后发现,相对于ALDH-组小鼠,ALDH1+组小鼠ALDH1表达升高,同时VE-cadherin,Twist1表达也升高,而E-cadherin表达降低。CD133+组小鼠对比CD133-组,CD133表达升高,同时VE-cadherin和Twist1表达升高,E-cadherin表达降低。4)endomucin/PAS双重染色结果显示,ALDH1+组小鼠中VM阳性率明显高于ALDH1-组。研究结论1、人三阴乳腺癌中CD44的表达高于非三阴乳腺癌,CD44阳性患者预后更差,CD44的表达与乳腺癌中VM、VE-cadherin表达和TNM分期呈正相关,CD24的表达同VM呈负相关。说明三阴乳腺癌其恶性程度高、患者预后差可能与乳腺癌干细胞的高含量有关,乳腺癌干细胞可能参与了肿瘤VM的形成。2、三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的ALDH1+和CD133+表型的肿瘤干细胞含量要高于非三阴乳腺癌细胞系MCF-7中的含量。相对于ALDH1-231细胞,ALDH1+231的迁移、侵袭和形成管道结构的能力更强,EMT相关蛋白表达升高,说明ALDH1+表型的乳腺癌干细胞有更强的VM形成能力,并且促进EMT相关蛋白的表达。3、在TA2高转移乳腺癌中ALDH1+和CD133+表型的肿瘤干细胞在TA2小鼠中成瘤能力更强,并影响EMT相关蛋白的表达,进而促进三阴乳腺癌中VM的形成。