[背景]细胞凋亡是在基因严密调控下的细胞程序性死亡过程。它是多细胞生物的一种细胞主动死亡形式，无论在生理条件下还是在病理条件下，在发育期还是在成体中都发挥重要作用，多细胞生物可借此机制消除损伤及不需要的细胞。因此，某些凋亡相关基因的突变将导致细胞凋亡受阻而使细胞处于无限生长状态，最终引起肿瘤的发生。目前关于凋亡的具体机制还不很清楚，因此，对凋亡机制及其信号传导途径的深入认识对肿瘤防治具有重要意义。 P38MAPK是MAPKs家族的重要成员之一，在应激状态下，与炎症反应及细胞凋亡关系密切。P38MAPK的活化在细胞凋亡过程中的作用尚不清楚。研究显示，在不同的应激因素刺激下，P38的激活既可促进凋亡的发生，又可起抑制凋亡的作用。其原因可能与细胞增殖分化状态及应激刺激的不同有关。目前，对P38MAPK的研究还处于探索阶段，进一步证实P38MAPK在基因毒性及其他应激刺激诱导肿瘤细胞凋亡中的作用意义重大。食管癌是我国较为常见的恶性肿瘤之一，目前尚未见关于P38MAPK在顺铂诱导食管癌细胞凋亡中作用的报道。本实验旨在探讨P38MAPK在基因毒性药物顺铂和可引起内质网功能障碍的化合物DTT诱导的食管癌细胞中的作用，为了解食管癌的凋亡发生机制提供新思路。 [材料与方法]本实验分两个阶段进行。 第一阶段实验：用DTT和顺铂诱导凋亡，并检测凋亡前后P38MAPK的磷酸化水平的变化。 将培养的Eca109细胞平均分为四组，在铺满瓶底70％时，用终浓度为2mmol/L的DTT，10μg/ml的顺铂及二药联合处理细胞，以未加药组作为对照郑州大学硕士学位论文应激活化的p38MAPK在DTT与顺铂诱导食管癌Ec。109细胞凋亡中的作用组。继续培养24小时，收集细胞进行免疫组化检测磷酸化P38MAPK和DNA抽提以琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。每组实验重复三次。免疫组化的操作按北京中山生物制剂有限公司提供的步骤进行。第二阶段实验:为进一步了解P38MAPK在DTT和顺铂诱导的细胞凋亡中的作用，应用磷酸化P38特异性抑制剂SB203580抑制磷酸化P38的活性，观察磷酸化P38的活性抑制前后细胞凋亡率的变化。 将培养的细胞平均分为八组:其中四组与第一阶段一致，另有一组为单独用DMSO处理组，余下组别分别用10ug/mlSB203580先孵育2小时，再分别用Zlnlnol/l的DTT，10ug/ml的顺铂及二药联合处理细胞。继续培养24小时后收集，应用流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率。应用SPSS 1 0.0软件对实验数据进行统计学分析。以a=0 .05为检验水准，运用秩和检验和X’检验分别对免疫组化数据和流式细胞仪检测结果进行统计学分析。结果1第一阶段实验结果1.1 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果、 用从DTT，顺铂及二者联合用药处理三组提取的DNA进行电泳，结果 均呈明显的laddor状，提示这三组均有明显凋亡存在，而对照组则未检测 到DNA 1 adder。表明DTT和顺铂均能诱导食管癌Eoal09细胞凋亡。1.2显微镜观察结果1.2.1免疫组化结果 以辣根过氧化物酶显色系统显示磷酸化P38MAPK的免疫组化信号为棕 黄色颗粒。结果显示，DTT和顺铂均能明显提高P38MAPK的磷酸化水平。 其中对照组阳性细胞数约为10%，DTT，顺铂及二者联合用药处理三组阳 性细胞数约为50%。与对照组相比，药物处理组的P38MAPK磷酸化水平均 明显提高(p(0.01)，提示P38MAPK参与了DTT和顺铂诱导的食管癌Eealog 细胞凋亡:DTT和顺铂处理组的P38MAPK磷酸化水平分别与联合用药组相 比，均无明显差别(p>0.05)。1.2.2观察细胞定位 DTT组:棕黄色颗粒主要存在于细胞核内，近胞膜处亦可见棕黄色颗郑州大学硕士学位论文应激活化的P38MAPK在D下r与顺铂诱导食管癌Ecal()9细胞凋亡中的作用 粒;顺铂组:棕黄色颗粒分布则较为弥散，胞浆、胞核和均可见明显的棕 黄色颗粒;DTT和顺铂联合用药组:在胞膜处及胞核内见明显的棕黄色颗 粒，着色较深，核转位很明显;对照组:着色很浅，仅少数细胞可见明显 的棕黄色颗粒。2第二阶段实验结果 抑制P38活性能抑制DTT和顺铂诱导的Ecal09细胞的凋亡。 流式细胞仪检测结果显示:对照组凋亡率为2.9%，各组与对照组相 比，均存在明显差异(p<0 .01)，提示DTT和顺铂均能诱导食管癌ECal的 细胞凋亡;DTT，顺铂及联合用药组凋亡率分别为16.8%，17.1%和21.4%; 加磷酸化P38的特异性抑制剂SB203580后，其凋亡率分别降至7.6%，7.8% 和7.6%，与加SB203580前相比，凋亡率明显下降(p(0.01)。提示 SB203580能明显抑制DTT和顺铂诱导的Eea109细胞凋亡，I〕38MAI，K在Dl’1’ 和顺铂诱导的Eca109细胞的凋亡中均发挥重要作用，P38MAPK的激活可 能是多种上游凋亡信号传导必经的共同通路;DTT处理组与联合用药组的 凋亡率相比有差别(0.01<p<0.05)，顺铂与联合用药组凋亡率相比则无明 显差别(p)0.05)。结论1 .DTT和顺铂均能诱导食管癌Eca109细胞凋亡。2.P38MAPK在DTT和顺铂诱导食管癌Eca109细胞凋亡中被显?