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目的： 研究融合型自杀基因Fcy∷Fur联合5-FC对卵巢癌细胞株HO-8910的杀伤效果。 方法： 1．根据逆转录病毒表达载体pLXSN和LZRSpBMN-Z的多克隆位点及质粒pORF5-Fcy∷Fur上Fcy∷Fur的基因序列，设计两对PCR引物，在引物的5’端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，采用常规PCR从pORF5-Fcy∷Fur中扩增出Fcy∷Fur融合基因，经核酸序列测定正确后，分别克隆进pLXSN和LZRSpBMN-Z。经双酶切鉴定后，分别转染包装细胞PT67和Pheonix，扩大培养阳性克隆并收集上清，获得重组逆转录病毒。 2．重组病毒感染靶细胞HO-8910，分别以G418和嘌呤霉素筛选得到稳定表达Fcy∷Fur的阳性细胞株(命名为HO-8910-Fcy∷Fur)，并经抽提细胞基因组DNA和RNA分别进行PCR和RT-PCR等鉴定目的基因的整合与表达。 3．在HO-8910-Fcy∷Fur中加入前药5-FC，MTT法测定肿瘤细胞杀伤效应并计算细胞生长抑制率，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞凋亡比例以及免疫组化检测凋亡相关蛋白Fas和Fas-L等的表达。 结果： 1．在成功构建逆转录病毒载体的基础上，转染包装细胞获得重组逆转录病毒，感染HO-8910后抗生素筛选获得HO-8910-Fcy∷Fur，南京医科大学硕上学位论文经PCR及RT-PCR鉴定无误。 2.倒置相差显微镜观察细胞形态发现，加入5一FC后，HO一8910一Fcy::Fur从第4天起发生形态改变，第5天部分细胞死亡，而未转染基因的HO一8910经5一FC作用后无明显形态改变。 3.5一FC终浓度为0.1、1、10、100、1000林mol/L的范围内，对正常未转染Fcy::F ur基因的Ho一89 10的生长无明显影响，而在5一FC终浓度大于10“mol/L时，对HO一8910一Fcy::Fur显示明显的生长抑制，5一FC的终浓度为1000林mol几，可使75%的细胞生长受抑制。 4.流式细胞仪检测实验组在正常二倍体细胞的Go/Gl峰前出现一个明显的凋亡峰，细胞凋亡率为33.8%，而正常HO一8910细胞经5一FC作用后，其凋亡细胞所占的百分率为2.86%。 5.免疫组化结果显示:正常的HO一8910细胞FaS和Fas一L染色均为阴性;而HO一8910一Fcy::Fur在加入5一FC4天后，Fas和Fas一L染色均为阳性。结论 融合型自杀基因Fcy::Fur联合5一Fc可对卵巢癌细胞株HO一8910产生明显的杀伤作用;凋亡可能参与了杀伤机制;5一FC加入后，发生了FaS和Fas一L表达的上调，提示杀伤机制可能与FaS和Fas一L诱导的凋亡相关。