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研究目的:氧化应激是指机体内部氧化与抗氧化反应系统失衡的一种状态,过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）会攻击具有重要生理学功能的大分子物质（如膜磷脂,蛋白质,DNA等）,对细胞的结构与功能造成损伤甚至会导致细胞死亡,即氧化应激损伤。氧化应激损伤参与多种心血管疾病的病理过程,如在心脏缺血-再灌注（ischemia/perfusion,I/R）损伤中,氧化应激损伤是最关键的发病机制。7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone,DHF）是天然黄酮类化合物的一种,能够特异性激活酪氨酸激酶B受体（tyrosine kinase B receptor,Trk B）从而发挥其重要的神经营养作用和保护作用。DHF对心血管功能的调节和保护作用已有较多报道,如DHF在大鼠体内具有舒血管效应和降压作用,DHF对过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导损伤的内皮细胞具有一定保护作用。但DHF对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用少有报道。本研究首先利用高浓度H2O2处理H9c2心肌细胞,建立心肌细胞氧化应激损伤的细胞模型,然后通过结扎大鼠左冠状动脉前降支（left anterior descending coronary artery,LAD）30 min后恢复血供3 h,建立了大鼠的心肌I/R损伤模型,探讨DHF对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用,并进一步探讨参与DHF保护作用的信号通路,尤其是DHF的抗内质应激作用。研究内容和方法:1.H9c2心肌细胞实验先用DHF预处理细胞1 h,再加入700μmol/L H2O2孵育24 h,通过MTT法检测细胞存活率,通过TUNEL法检测细胞的凋亡水平,观察DHF对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。通过Western blot法检测Nrf2/HO-1通路、Trk B/Akt信号通路和内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）相关蛋白表达的水平,进一步探讨参与DHF保护作用的可能机制。2.动物实验Wistar大鼠随机分为三组:假手术组（Sham）、I/R模型对照组（I/R）、药物治疗组（I/R+DHF）,每组6-7只。Sham组动物打开胸腔,LAD只穿线不结扎,I/R和I/R+DHF组LAD结扎30 min再恢复供血3 h,恢复血供前10 min腹腔注射对照溶剂或DHF（10 mg/kg）。各组动物分别处死后,从心脏取血、取结扎位置以下的心肌组织进行各种检测。主要检测包括:（1）TTC染色鉴定大鼠的I/R模型是否成功;（2）血清心肌酶学检测:利用速率法检测血清中乳酸脱氢酶（LDH）的含量,利用免疫抑制法进行检测血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量;（3）利用Western blot方法检测Nrf2/HO-1信号通路、Trk B/Akt信号通路以及ERS相关蛋白表达。研究结果1.以H2O2（100-800μmol/L）处理24 h均可诱导H9c2心肌细胞的氧化应激损伤,其中700μmol/L H2O2使细胞存活率下降至（0.57±0.01）（P<0.01）。DHF（5-20μmol/L）预处理1 h对H2O2（700μmol/L,24 h）损伤的心肌细胞具有明显的保护作用,其中DHF（10μmol/L）使细胞存活率升至（0.72±0.02）（P<0.01）,其保护作用最为显著。后续实验中,DHF和H2O2的浓度分别选择10μmol/L和700μmol/L。2.H9c2心肌细胞TUNEL荧光染色的结果显示:与对照组相比,细胞经过H2O2处理24 h后,TUNEL阳性细胞数明显提升（55.7%±9.4%v.s 2.1%±0.4%,P<0.01）;DHF预处理使凋亡细胞数明显减少（23.9%±5.4%v.s 55.7%±9.4%,P<0.05）,DHF单独处理组的凋亡细胞数与对照组相近。3.检测H9c2心肌细胞Nrf2/HO-1信号通路结果:与对照组相比,H2O2处理组和DHF预处理组的细胞转录因子Nrf2和下游的血红素加氧酶-1（heme oxygenase,HO-1）蛋白水平均没有发生明显改变。Nrf2/HO-1通路是细胞内具有重要抗氧化应激作用的一条信号通路,本实验结果提示该信号通路可能不参与DHF对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用。4.检测H9c2心肌细胞内Trk B/Akt信号通路结果:与对照组相比,H2O2处理明显降低了细胞内p-Trk B蛋白的表达（0.77±0.02 v.s 1.06±0.06,P<0.05）和p-Akt的表达（0.47±0.04 v.s 0.89±0.06,P<0.05）,而DHF预处理明显增加了p-Trk B（1.10±0.08v.s 0.77±0.02,P<0.05）和Akt的蛋白表达水平（0.81±0.06 v.s 0.47±0.04,P<0.05）。5.检测H9c2心肌细胞ERS相关蛋白结果发现:与对照组相比,H2O2显著提高了细胞内GRP78（0.98±0.17 v.s 0.42±0.07,P<0.01）和CHOP（1.20±0.12 v.s 0.79±0.07,P<0.05）的蛋白表达,同时降低了未激活的Caspase12蛋白表达（0.73±0.04 v.s1.23±0.16,P<0.05）。而给予DHF预处理增加了GRP78（0.52±0.03 v.s 0.98±0.17,P<0.05）和CHOP（0.83±0.05 v.s 1.20±0.12,P<0.05）的表达,同时提高了Caspase12蛋白水平（1.25±0.14 v.s 0.73±0.04,P<0.05）。提示H2O2引发了H9c2心肌细胞的ERS和内质网途径的凋亡,而DHF可拮抗上述异常变化。6.大鼠心脏TTC染色发现:大鼠心脏结扎LAD 30 min后恢复血液供应3 h,能造成明显的I/R损伤,其中红色区域为正常心肌组织,白色区域为缺血梗死的心肌组织。提示大鼠的心肌I/R损伤模型成功建立。7.大鼠血清LDH和CK-MB含量检测发现:与Sham组相比,I/R组LDH和CK-MB分别升高了55%（2466±75.66 v.s 1596±145.5,P<0.01）和97.9%（1215±154.8 v.s614±104.1,P<0.05）;与I/R组相比,DHF治疗组血清LDH含量（1868±103.9 v.s2466±75.66,P<0.05）和CK-MB含量（1726.4±102.6 v.s 1215±154.8,P<0.05）均出现明显下降。该结果提示DHF对大鼠I/R损伤具有一定的保护作用。8.检测心肌组织Trk B/Akt信号通路发现:与Sham组相比,I/R组心肌组织中p-Trk B表达出现下降（1.44±0.06 v.s 1.94±0.07,P<0.05）,而p-Akt表达也有较为明显的降低（0.49±0.09 v.s 1.16±0.03,P<0.05）;再灌注前腹腔注射给予DHF后,I/R+DHF组心肌组织中的p-Trk B水平明显提高（1.93±0.21 v.s 0.85±0.09,P<0.05）,同时p-Akt表达升高（1.02±0.18 v.s 0.49±0.09,P<0.05）。该结果表明DHF对大鼠心肌I/R损伤的保护可能通过激活Trk B/Akt信号通路发挥作用。9.检测心肌组织ERS相关蛋白发现:与Sham组相比,缺血再灌注导致GRP78水平明显提高（1.14±0.24 v.s 0.33±0.05,P<0.05）和CHOP表达升高（1.59±0.31 v.s0.57±0.09,P<0.05）,e IF2α活化也明显增多（1.57±0.22 v.s 0.75±0.08,P<0.05）;而DHF预处理明显降低了GRP78表达水平（0.49±0.04 v.s 1.14±0.24,P<0.05）和CHOP的表达水平（0.73±0.15 v.s 1.59±0.31,P<0.05）。此外,I/R组心肌组织Caspase12水平降低（1.14±0.06 v.s 1.57±0.09,P<0.05）,而给予DHF后,Caspase12升高水平（1.49±0.11 v.s 1.14±0.06,P<0.05）。以上结果证明DHF对I/R心肌组织的保护作用可能与它能够拮抗内质网应激有关。结论:综上所述,7,8-二羟基黄酮（DHF）对H9c2心肌细胞氧化应激损伤和大鼠I/R损伤均具有明显的保护作用,该作用可能和DHF能够特异性激活Trk B/Akt信号通路,尤其DHF的抗内质网应激作用密切相关。