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缺血性脑卒中是全球致残和死亡的重要原因之一,80%的患者伴随神经功能障碍。脑卒中后,中枢神经系统的修复与重建对其功能的恢复至关重要,是目前研究的重点。研究表明,神经干细胞（Neural stem/progenitor cells,NSPCs）是细胞替代疗法治疗中枢神经系统损伤的关键细胞。NSPCs可增殖、迁移至病灶,并分化为神经元和神经胶质细胞,通过营养支持、调节炎症反应、定向分化替代神经元、重建神经环路和功能、旁分泌神经生长因子等作用发挥治疗效果,从而促进损伤后修复。缺血性脑卒中发生后,由于血脑屏障受损,兴奋性毒性和神经炎症明显破坏了细胞微环境。即在受损的脑组织中,细胞微环境出现明显病理性环境,该环境不利于内源性NSPCs（endogenous NSPCs,eNSPCs）的存活、神经发生及分化。eNSPCs活化策略是利用eNSPCs的固有特性（增殖扩大eNSPCs的数目、迁移到损伤部位并分化为成熟神经细胞参与神经网络重建）,通过使用各种外源性"激活因子"以激活大脑中的eNSPCs。因此,研究促进eNSPCs激活的药物及潜在机制有重要的临床意义。L-抗坏血酸（Ascorbic acid,AA）又称维生素C（Vitamin C）。前期研究发现,用AA连续预处理3周或连续治疗2周,可显著减少MCAO大鼠的脑梗面积,改善MCAO大鼠的神经功能。钠离子依赖的维生素C转运蛋白2（Sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）是AA的特异性转运蛋白,广泛表达于脑组织内,在神经元、小胶质细胞、脉络丛上皮细胞等,AA不能通过血脑屏障,必须借助SVCT2的转运才能进入脑内。近期研究发现,SVCT2表达于放射状胶质细胞、神经干细胞,过表达SCVT2或者用AA干预可以促进NSPCs向神经元分化。然而,SVCT2和AA干预对神经干细胞的迁移作用仍不清楚。青蒿素的水溶性衍生物-青蒿琥酯（Artesunate,ART）具有低毒性的特点,可以很容易地穿透血脑屏障,已被广泛用于疟疾的治疗。由于其在抗肿瘤、防止器官损伤和功能障碍、免疫和炎症调节、神经传递调节以及治疗I型糖尿病方面的潜在作用,已被广泛研究。在我们以前的研究中,证实ART可通过激活鞘氨醇1磷酸受体1/磷脂酰肌醇3激酶（S1pR1/PI3K）信号通路来保护蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）小鼠的血脑屏障,体外研究初步发现ART也可通过PI3K/Akt信号通路促进神经干细胞的增殖。然而,目前尚无研究阐明ART对缺血性卒中后神经发生和神经损伤的影响。因此,本文探索AA及其转运体SVCT2,以及ART调控内源性神经干细胞激活在缺血性脑卒中损伤的作用与机制,为内源性神经干细胞治疗缺血性脑卒中提供了新的治疗药物和干预靶点。一、AA和SVCT2通过促进神经干细胞迁移改善缺血性脑卒中损伤的作用与机制研究目的:探讨SVCT2过表达和AA干预对NSPCs迁移和缺血性脑卒中损伤的作用与机制。设计与方法:建立短暂性小鼠MCAO模型（tMCAO）,采用免疫荧光和蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）检测MCAO后小鼠的SVCT2表达水平。过表达SVCT2与AA联合应用后,利用转轮疲劳实验（Rotarod test）、转角实验（Corner test）和平衡木实验（Beam walking）来检测MCAO模型小鼠的运动行为学,采用TTC染色来观察MCAO模型小鼠脑梗的体积。过表达SVCT2的同时给予Brdu注射,观察MCAO小鼠沿胼胝体迁移的NSPCs状态及脑梗周围皮层及基底节区Brdu阳性神经元的数目。进一步,体外建立NSPCs的氧-葡萄糖剥夺/复氧复糖（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-glucose,OGD/R）模型,将细胞分为Control、OGD、OGD+400μM AA、OGD+LV-SVCT2、OGD+400μM AA+LV-SVCT2五组,观察对NSPCs迁移的影响;利用tubulin和鬼笔环肽（phalloidin）免疫荧光染色,观察各组NSPCs的丝状伪足改变;采用WB检测SVCT2、CDC42、F-actin的表达水平。最后,利用CDC42的特异性抑制剂ZCL278来干预NSPCs,观察CDC42的抑制能否反转SVCT2过表达引起的NSPCs迁移效应,同时证明SVCT2过表达对NSPCs迁移的促进作用是通过CDC42介导的。结果:体内实验发现,250 mg/Kg AA干预可显著减轻MCAO后小鼠脑梗体积和运动功能障碍,免疫荧光及WB实验结果发现SVCT2蛋白表达水平在MCAO后1天、3天、7天及14天时均有显著降低。SVCT2过表达和AA的联合应用不仅可显著改善MCAO后小鼠脑梗体积和运动功能障碍,而且可促进NSPCs的迁移、诱导其向神经元分化,但对NSPCs的数目无显著性影响。体外实验结果表明,200μM、400μM和1 mM的AA可显著促进NSPCs的迁移。SVCT2的过表达可显著促进NSPCs的迁移,而SVCT2的shRNA干预却显著抑制了NSPCs的迁移。在SVCT2过表达的同时进行400μM AA处理,则可进一步促进NSPCs的迁移。OGD/R损伤后,DCX阳性的神经元前体细胞上SVCT2表达显著减低,并降低CDC42/F-actin通路分子的表达、抑制NSPCs迁移,而OGD/R损伤后进行AA干预和SVCT2过表达则可以显著促进CDC42/F-actin通路分子的表达,促进NSPCs迁移。进一步地,使用ZCL278干预CDC42也显著抑制了NSPCs丝状伪足的形成以及迁移中NSPCs一级及二级分支的数目,并反转了SVCT2促丝状伪足形成的作用。结论SVCT2在缺血性脑卒中损伤后表达显著降低,可能是导致临床使用AA干预缺血性脑卒中病人效果不佳的原因。应用L-抗坏血酸（AA）及过表达其转运体SVCT2可以通过CDC42/F-actin发挥促进NSPCs迁移的作用,SVCT2过表达与AA联合使用显著缓解了缺血性脑卒中损伤小鼠的运动功能障碍和脑梗体积。二、青蒿琥酯通过调控缺血性脑卒中后神经再生减轻缺血性脑卒中损伤的体内研究目的探讨ART调控缺血性脑卒中后神经再生以减轻缺血性脑卒中损伤的效应,证实PI3K/Akt/FOXO3a/p27kip1信号通路在其中的作用。设计与方法采用不同浓度ART（50 mg/kg、150 mg/kg和250 mg/kg）干预MCAO小鼠后评估ART对小鼠运动功能恢复的影响。150 mg/kg ART干预和过表达FOXO3a处理MCAO小鼠后,用TTC染色分析法检测脑梗死体积,用磁共振弥散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI）、透射电子显微镜和Tuj1免疫荧光测定白质损伤,用免疫荧光染色检测DCX、GFAP和Brdu在SVZ和病灶周围皮层中的水平。为了进一步研究PI3K/Akt信号通路在ART诱导的损伤保护效应中的作用,采用150 mg/kg ART和1 mg/kg渥曼青霉素（PI3K抑制剂）干预MCAO小鼠,用功能行为测试评估MCAO后1、3、7和14天的运动功能,用TTC染色分析法评估脑梗死体积,用WB检测MCAO后3天的PI3K/Akt/FOXO3a/p27kip1相关分子及NSPCs标志物Nestin的表达。结果150 mg/kg ART显著增强了神经功能评分、旷场实验和跑梯实验的评价结果。MRI的T2加权图像以及TTC染色显示,MCAO损伤后三天,150 mg/kg ART干预可降低小鼠的脑梗死体积。DTI成像、电子显微镜和Tuj1免疫荧光染色的结果表明,150 mg/kg ART还可减轻小鼠MCAO后损伤侧内囊区的白质纤维束的损害。通过比较MCAO三天后同侧SVZ中DCX+和Brdu+细胞的数目以及病灶周围皮层DCX+和Brdu+细胞的数目,我们发现150 mg/kg ART可以激活NSPCs,使其迅速增殖和神经元向性分化。我们还发现过表达FOXO3a后脑梗死体积显著增加、运动神经功能缺损加重、损伤侧白质损伤加重以及脑梗死周围区域的神经发生降低。采用WB检测FOXO3a/p27kip1/Cyclin E/CDK2信号相关分子和Nestin的表达水平进一步证实ART通过FOXO3a/p27Kip1信号通路对小鼠MCAO后损伤起保护作用。使用PI3K抑制剂渥曼青霉素后,脑梗死体积显著增加、运动行为学功能显著下降;采用WB检测PI3K/Akt/FOXO3a/p27Kip1信号相关分子(p-AKT、p-FOXO3a、p27kip1)和Nestin的表达水平进一步证实,ART通过PI3K/Akt信号通路促进了FOXO3a的磷酸化,下调了P27kip1,对小鼠MCAO后损伤起保护作用。结论ART通过PI3K/Akt/FOXO3a/p27kip1途径促进神经发生,从而挽救了半暗带损伤,减轻了白质损伤,并有助于缺血性脑卒中后功能的恢复。三、青蒿琥酯调控神经干细胞增殖和分化以及OGD/R损伤的体外研究目的探讨ART对NSPCs增殖和分化的影响;构建NSPCs的体外OGD/R损伤模型,证实ART通过PI3K/Akt/FOXO3a/p27Kip1信号通路促进OGD/R后NSPCs的增殖。方法采用CCK8检测不同浓度的ART（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8和25.6μmol/L）对NSPCs和OGD/R损伤后NSPCs增殖的影响,用WB和RT-qPCR检测ART（0、0.4、0.8和1.6μmol/L）处理72 h的NSPCs和OGD/R后NSPCs中Nestin的表达水平,用流式细胞术检测0.8μmol/L ART对NSPCs细胞周期的影响,用DCX和GFAP的免疫荧光染色确定0.8μmol/L ART对NSPCs神经元向性分化的影响。以0.4μmol/L ART和0.1μmol/L PI3K抑制剂渥曼青霉素干预OGD/R后NSPCs,用CCK8测定法检查干预24 h和72 h后的NSPCs增殖,用WB检测NSPCs中PI3K/Akt/FOXO3a/p27kip1信号相关分子和Nestin的表达。结果0.8μmol/L ART干预后能够明显促进NSPCs的增殖、增加DCX+细胞的百分比、降低GFAP+细胞的百分比。0.4μmol/L ART干预能够明显促进OGD/R后NSPCs的增殖,同时ART能够明显上调p-AKT和p-FOXO3a的表达水平、下调p27kip1的表达水平;PI3K抑制剂渥曼青霉素干预后能够反转ART对OGD/R后NSPCs增殖的影响。结论0.8μmol/L ART干预后能够明显促进NSPCs的增殖,并促进NSPCs神经元向性分化;0.4μmol/L ART能够激活PI3K/Akt/FOXO3a/p27kip1信号通路,促进OGD/R后NSPCs增殖。