微生物腈水合酶的发酵及性质研究

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腈水合酶(Nitrile Hydratase EC4.2.1.84,简称NHase)是一种微生物酶,它可催化多种腈化合物水合生成酰胺。本文主要研究了红球菌Rhodococcus rhodochrous J1产生的腈水合酶的产生条件,酶学性质及应用(丙烯腈作为主要底物)。包括了菌种培养条件的优化;自由细胞直接进行酶催化反应的条件研究并与固定化细胞相比较;酶蛋白的分离纯化及性质研究;自由细胞连续反应的小试试验。实验得到如下结论:调节培养基各组分、培养温度、pH等可以使发酵液的腈水合酶活力达到6150u/ml,超过文献报道。温度为30℃,反应体系呈中性可以使酶在具有很高活性的同时保持稳定性。对底物浓度,酶浓度,反应时间的正交实验表明,底物丙烯腈是显著因子,最佳浓度为5%,超过此浓度会使酶失活;在菌体浓度为OD460=10,底物丙稀腈浓度为5%,温度30℃,pH=7.2的优条件下,1min内,底物的转化率可达80%,10min后转化率即可达99%。超过30%的丙烯酰胺会抑制酶的活性。分离纯化酶蛋白,得到了具有活性的酶蛋白,并测得其亚基数目及大小,与文献资料相符合;纯化后的酶稳定性显著降低。在应用方面,以海藻酸钙,海藻酸钡,聚丙烯酰胺等作包埋剂对菌体进行固定化,固定化细胞催化剂催化能力大大降低,稳定性却没有大的改善,不能提高催化反应的效率。以自由细胞进行连续催化反应,可使丙稀酰胺的浓度在20min内达到30%,20min转化率达到99%,具有高效率,是适合工业生产的方法。
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