我国肝癌死亡率在所有恶性肿瘤中居第3位。虽然经过多年探索，人们对肝癌的发生、发展的机制认识逐步提高，但原发性肝细胞癌治疗并不十分理想，复发、转移仍是最大的难题。 目前越来越多的研究显示在恶性实体瘤中存在一群数量极少的，具有自我更新能力、多向分化潜能、体内成瘤能力的未分化细胞，这些细胞被称为癌干细胞。虽然癌干细胞在肿瘤组织中所占比例极小，但癌干细胞在肿瘤的发生、发展、转移、复发中起重要的作用。因此，针对癌干细胞的防治才是今后防治恶性肿瘤的重点，而进行癌干细胞分离、分选、鉴定、培养、扩增是研究癌干细胞的生物学特性及针对癌干细胞进行相应防治研究的首要步骤。由于癌干细胞在肿瘤中的数量极少，纯化困难且目前几种分选方法都存在不足等原因，限制了癌干细胞研究的发展。癌干细胞的分离、鉴定及纯化成为癌干细胞研究的瓶颈。因此，寻找有效可行的富集纯化肝癌干细胞的方法，实为当务之需。 由于癌干细胞多处于G0/G1期，表达大量耐药基因，对化疗不敏感，因而提示我们能否通过化疗处理肝癌，使对化疗敏感的癌细胞被杀死，而对化疗不敏感的肝癌干细胞就被富集出来。 研究目标: 1、建立富集肝癌干细胞的方法，解决肝癌干细胞研究中因癌干细胞数量少所致的瓶颈问题。 2、比较利用低剂量环磷酰胺富集肝癌干细胞在不同剂量、不同化疗时长情况下的富集效率。 研究方法: 围绕上述目标，本研究采用以下研究方法： 1、获得经过低剂量环磷酰胺富集的肝癌细胞： 将SMMC—7721细胞株种植于裸鼠颈背部皮下，形成的异种异植瘤在体内连续传三代，同时给予不同低剂量化疗药环磷酰胺（0mg/Kg，2mg/Kg，5mg/Kg，10mg/Kg）富集肝癌细胞。 2、比较低剂量环磷酰胺富集的肝癌干细胞效率的体外实验： 通过球囊形成率比较在不同化疗压力下富集的三代肝癌干细胞的体外自我更新能力；使用MTT法比较不同化疗压力下富集的三代肝癌干细胞的分化增殖能力；通过软琼脂克隆形成率和平板克隆形成率比较这三代在化疗压力下富集的肝癌干细胞的克隆增殖能力；通过ELISA法比较肝癌干细胞的分化能力；通过流式细胞分析的方法检测朊蛋白的表达，以评价朊蛋白是否可做为肝癌干细胞的标志物；应用流式细胞分析的方法检测SP细胞含量，比较在不同化疗压力及不同化疗时长下富集肝癌干细胞的效率。 3、比较低剂量环磷酰胺富集的肝癌干细胞效率的体内实验： 通过将不同数量级的经不同剂量环磷酰胺富集的三代肝癌干细胞接种到裸鼠颈背部皮下，观察比较它们的体内成瘤能力，以比较不同化疗压力及不同化疗时长下富集肝癌干细胞的效率。 研究结果: 获得的利用低剂量环磷酰胺富集的三代肝癌细胞的活性在95％以上，符合实验要求，为实验研究提供了合适的研究对象。 经环磷酰胺富集的肝癌细胞在体外表现出较强的“干”细胞特性：较强的自我更新、克隆形成、增殖、耐药能力，且富集肝癌干细胞的效率随着环磷酰胺的剂量增加而增加，随着富集时间的延长而增加。在这三代经过环磷酰胺富集的肝癌细胞中，利用10mg/Kg环磷酰胺富集的第三代肝癌细胞表现出较强的“干性”。而实验证明朊蛋白不是肝癌干细胞的表面标志物。 在体内成瘤能力的比较中，化疗富集肝癌干细胞的效率随着环磷酰胺的剂量增加而增加，随着富集时间的延长而增加。在三代经过环磷酰胺富集的肝癌细胞中，利用10mg/Kg环磷酰胺富集的第三代肝癌细胞的体内成瘤能力最强。 结论: 1、低剂量环磷酰胺可以富集肝癌干细胞，使其在肝癌细胞中的相对比例增加。 2、低剂量环磷酰胺富集肝癌干细胞的富集效率与环磷酰胺的剂量成正比；与化疗时间的长短成正比。