论文部分内容阅读
目的:将通过高通量测序和质谱鉴定初步筛选到的正常B血型成人外周血中,天然单克隆A血型抗体中的12条重链、8条轻链进行体外表达并鉴定,建立从B血型人外周血中A血型抗体克隆的新的鉴定方法,为进一步研究血型抗体在ABO血型不相容肾移植免疫适应机制中的作用提供实验方法。材料与方法:(1)分别构建抗体重链和轻链的表达载体:以载体p VITRO1-Trastuzumab-Ig G1/κ、p VITRO1-102.1F10-Ig M/λ为模板,设计磷酸化引物进行PCR,环化自连,构建p61883Hg、p61883Lk、p61880Hm、p61880La四个载体,分别用于Ig G重链、κ轻链、Ig M重链、λ轻链的表达。(2)将前期筛选到的20条抗体可变区分别克隆至上述抗体的表达载体:分别使用设计的引物对抗体可变区及表达载体进行PCR,在体外进行重组后,转化感受态细菌,涂板。PCR筛选阳性克隆,并测序验证。(3)抗体的鉴定:12种重链质粒与8种轻链质粒一一配对,共96种组合,分别转染人胚肾293细胞,收集96份细胞培养上清液,利用狭缝杂交鉴定正确的A血型单克隆抗体。结果:(1)对构建的p61883Hg、p61883Lk、p61880Hm、p61880La4个质粒使用双酶切验证,酶切产物与理论条带一致,载体构建成功。(2)重组反应产物转化产生20种菌落,每种菌落进行菌落PCR均筛选出阳性克隆。使用测序验证,最后,12条重链、8条轻链的均成功克隆至表达载体。(3)利用狭缝杂交发现,其中至少有一个抗体能特异结合A抗原,另有若干抗体能够识别前期用于筛选的A抗原的偶联蛋白。结论:(1)成功地在体外使用293细胞表达抗体,并筛选到单克隆A血型抗体。(2)用B血型人外周血鉴定其体内A血型抗体克隆是可行的。