第一部分TOLL样受体介导的中枢神经炎症反应在术后认知功能障碍中的作用目的:探讨TOLL样受体介导的脑内神经炎症反应在无菌性手术创伤引起的术后认知功能障碍中的作用。方法:构建异氟醚麻醉下行颈动脉剥离手术的小鼠手术模型,首先,将CD-1小鼠随机分为手术组和对照组(n=6),通过蛋白印迹法检测术后6小时小鼠大脑皮质和海马组织的总蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4、TLR9的表达情况;其次,将CD-1小鼠随机分为:对照组、CUCPT22(TLR1/TLR2抑制剂)组、手术组、手术+CU-CPT22组,CUCPT22于手术前30分和术后一天分别予腹腔内注射3 mg/kg,通过巴恩斯迷宫和条件相关恐惧实验测定小鼠术后学习记忆能力的变化(n=15),通过Elisa法检测术后12小时小鼠大脑皮质和海马组织内IL-1β、IL-6的表达(n=6);最后,通过双染色免疫荧光技术观察TLR2分别与神经元标记物(Neu N)、星形胶质细胞标记物(GFAP)、小胶质细胞标记物(Iba-1)的定位情况。结果:与对照组比较,右颈动脉剥离术后6小时的大脑皮质和海马的总蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4表达均明显增高(P<0.05),而TLR9的总蛋白和膜蛋白表达与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。与对照组比较,术后12小时大脑皮质和海马的IL-6表达及大脑海马的IL-1β表达明显增高(P<0.05),CU-CPT22处理后能明显减轻手术创伤诱导的大脑皮质和海马的IL-1β和IL-6表达。在四天的空间记忆训练过程中,训练天数对大鼠找到目标洞的时间有显著性影响(P<0.05);在长期记忆测试中,手术组的小鼠找到目标洞的时间较对照组明显增加(P<0.05),CUCPT22处理后能明显缩短手术创伤后小鼠找到目标洞的时间(P<0.05),在短期记忆测试中,有相同的变化趋势,但是其结果没有统计学意义(P>0.05)。在背景相关恐惧记忆测试中,手术组小鼠的凝固行为时间比对照组明显减少,CU-CPT22能明显增加手术创伤后小鼠的凝固行为时间(P<0.05);在声音相关恐惧记忆测试中,各个组小鼠的凝固行为时间之间比较没有显著性差异(P>0.05)。免疫荧光结果显示:手术刺激后TLR2在小鼠脑内的表达明显增多,TLR2的表达位点与Neu N明显重合,与Iba-1部分重合,与GFAP完成不重合。结论:无菌性手术创伤导致的术后认知功能障碍与脑内TLR2、TLR4激活介导的中枢神经炎性反应有关;手术创伤后脑内TLR2的激活主要来源于神经元细胞和小胶质细胞。第二部分脑内HMGB1的激活对TLR2表达的影响及其调控机制研究目的:探讨无菌性手术创伤后,脑内HMGB1对TLR2表达的影响以其调控机制。方法:构建异氟醚麻醉下行颈动脉剥离手术的小鼠手术模型,首先,将CD-1小鼠随机分为手术组和对照组(n=10),通过蛋白印迹法检测术后6小时小鼠大脑皮质和海马组织的核蛋白和浆蛋白中HMBG1的表达情况;其次,将CD-1小鼠随机分为:对照组、Glycyrrhizin(HMGB1抑制剂)组、手术组、手术+Glycyrrhizin组(n=6),Glycyrrhizin于手术前30分腹腔内注射200 mg/kg,通过蛋白印迹法检测术后6小时小鼠大脑皮质和海马组织的核蛋白和浆蛋白中HMBG1的表达以及总蛋白和膜蛋白TLR2的表达情况;最后,通过染色质免疫沉淀实验(Ch IP)检测HMGB1对TLR2启动子区域转录水平的调控。结果:与对照组比较,右颈动脉剥离术后6小时的大脑皮质和海马的核蛋白HMGB1表达明显增高(P<0.05),而浆蛋白HMGB1表达与对照组无显著性差异(P>0.05),Glycyrrhizin预处理能明显减轻手术创伤引起的核蛋白HMGB1表达增高(P<0.05)。与对照组比较,术后大脑皮质和海马的总蛋白和膜蛋白中TLR2表达均明显增高,Glycyrrhizin预处理能明显减轻手术创伤引起的TLR2表达增高(P<0.05)。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中,PCR检测显示手术组的海马组织在-283bp~-71 bp启动子区域的TLR2 DNA含量比对照组明显增高(P<0.05)。结论:抑制HMGB1在脑内的表达能有效减少手术创伤后脑内TLR2的激活;HMGB1可通过激活-283bp~-71 bp区域的TLR2启动子,促进TLR2的转录过程来实现对TLR2的调控作用。第三部分HMGB1/TLR2信号通路在肺缺血再灌注损伤中的作用目的:探讨HMGB1/TLR2信号通路在缺血再灌注肺损伤发生过程中的作用。方法:构建小鼠肺缺血再灌注损伤的动物模型,首先,将BALB/C小鼠随机分为对照组(Control组)、假手术组(Sham组)和缺血再灌注组(I/R组)组(n=6),收集缺血再灌注侧肺组织标本通过HE染色法观察肺组织损伤情况并评分,通过检测肺湿干重比评价肺水肿情况,通过蛋白印迹法检测小鼠肺组织总蛋白TLR2的表达、核蛋白和浆蛋白HMGB1的表达,通过Elisa检测肺组织IL-1β和IL-6等炎症因子的表达;其次,将BALB/C小鼠随机分为对照组(Control组)、Glycyrrhizin(HMGB1抑制剂)组、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+Glycyrrhizin组(I/R+Gly组),Glycyrrhizin于手术前30分腹腔内注射200 mg/kg,同样收集缺血再灌注侧肺组织标本检测各组肺组织的肺损伤评分、肺湿干重比、HMGB1和TLR2蛋白的表达、以及炎症因子IL-1β、IL-6的表达;最后,通过染色质免疫沉淀实验(Ch IP)检测HMGB1对TLR2启动子区域转录水平的调控。结果:HE染色后光镜下观察显示:Control组:肺组织未见病理改变,肺泡结构和各级支气管上皮完整,肺泡间隔正常,无明显肺间质水肿,无炎性细胞浸润;Sham组:肺组织未见明显的病理改变,肺泡结构和各级支气管上皮大部分完整,肺间隔稍增宽,可见有少量炎性细胞浸润;I/R组:肺组织损伤明显,肺泡间隔结构破坏明显,肺泡内可见明显水肿及出血,大量炎性细胞侵润。肺损伤评分分别为:对照组:1.6±0.3;Sham组:12.4±1.3;I/R组:28.5±2.1。与Control组和Sham组比较,I/R组肺组织的W/D比值显著升高(P<0.05),核蛋白和浆蛋白中HMGB1表达、TLR2总蛋白表达均明显增高(P<0.05);炎症因子IL-1β和IL-6的表达亦显著升高(P<0.05)。Control组和Sham组之间比较,Sham组也能导致肺损伤一定程度的损伤,HMGB1核蛋白、TLR2总蛋白表达明显增高(P<0.05),但HMGB1浆蛋白无明显变化(P>0.05);炎症因子IL-1β和IL-6的表达亦显著升高(P<0.05)。与I/R组相比,I/R+Gly组能显著抑制HMGB1、TLR2总蛋白的表达,抑制炎症因子IL-1β和IL-6的表达,并减轻缺血再灌注导致肺损伤的程度。Control组和Glycyrrhizin组之间比较各项指标无统计学差异(P>0.05)。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中,PCR检测显示缺血再灌注组的TLR2启动子区域的DNA含量与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:肺缺血再灌注损伤与HMGB1、TLR2蛋白表达介导的炎症反应相关;Glycyrrhizin预处理抑制HMGB1的表达可降低TLR2介导的肺内炎症反应,并可减轻缺血再灌注致肺损伤的程度。