本研究利用体外培养的新生牛单层肝细胞，采用荧光定量PCR方法检测不同浓度胰高血糖素、瘦蛋白对肝糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)mRNA表达的影响。首先，根据GenBank上发表的牛PEPCK序列，设计一对外围引物、一对内围引物、一个MGb荧光探针；然后应用外围引物进行常规RT-PCR，成功扩增出PEPCK目的片段，大小为337bp，并将其克隆到pMD-18T载体上测序。其测序结果与GenBank上的序列进行同源性比较，与发表的基因序列同源性为99％，只有一个碱基发生突变，且该突变未发生在探针范围内，表明基因克隆结果正确可用于阳性质粒标准品的制备。随后利用该质粒作为标准品进行荧光定量PCR，绘制出标准曲线，成功建立了检测该基因的方法。通过实验证明该方法灵敏度高、稳定性强，可以用于检测PEPCK基因的表达。 本实验在参考国内外有关文献的基础上，采用传统的酶消化法和机械碾磨法成功地进行了新生牛体外肝细胞的原代培养。通过在原代培养的新生牛肝细胞中分别添加不同浓度的胰高血糖素、瘦蛋白检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA的变动规律。培养液中胰高血糖素浓度分别为(0、1、10、100和1000nmol/L)，瘦蛋白浓度分别为(0、2.5、5.0、10和50ng/mL)；培养12h后，提取总RNA，进行反转录；用反转录产物为模板，通过已经建立的荧光定量PCR方法检测肝细胞PEPCKmRNA表达水平。结果显示：随着胰高血糖素浓度的升高，肝细胞PEPCKmRNA表达的水平随之增强；随着瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCKmRNA表达的水平呈现无规则不显著变化。说明胰高血糖素促进肝糖异生作用，但是瘦蛋白对肝PEPCKmRNA表达未产生直接的影响。