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目的:
本研究利用本室早期构建的pET24a-SA-L-hIFN-α2a重组表达质粒，在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-hIFN-α2a，并对所表达的蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析进行纯化，尿素梯度透析复性，大量制备链亲合素(SA)标记的人源α2a型干扰素融合蛋白(SA-hIFN-α2a)，并对其体外活性进行检测，为进一步的动物实验奠定基础。
方法:
1．诱导表达SA-hIFN-α2a融合蛋白
用传统的CaCl2方法制备Rosetta感受态细胞，首先从大肠杆菌DH5α(由本室保存，含质粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a)中提取目的质粒，将质粒转化入感受态细胞中进行活化，经IPTG诱导表达，高压细胞破碎仪破菌，包涵体洗涤。最后应用SDS-PAGE分析检测表达产物。
2．融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG诱导条件的优化
通过调整IPTG的诱导时间和诱导浓度，应用SDS-PAGE鉴定结果，筛选出最佳的诱导条件。
3．WesternBloting鉴定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表达
通过对未经IPTG诱导表达的菌液和表达后的产物进行免疫印迹分析鉴定，以hIFN-α2a抗体为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记-羊抗鼠IgG为二抗，采用DAB显色法进行显色，以鉴定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表达情况。
4．包涵体洗涤、纯化及复性
通过细胞压力破碎仪破菌收得包涵体(镍柱亲和层析)，应用本室已成功研制的包涵体洗涤方法进行洗涤，包涵体经过洗涤后用8M尿素溶解进行镍柱亲和层析纯化，通过尿素梯度透析复性后得到融合蛋白，进行SDS-PAGE鉴定结果，并分析复性后蛋白的纯度和浓度。
5．干扰素抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验
将复性的SA-hIFN-α2a融合蛋白采用微量细胞病变抑制法通过A549/VSV系统测定SA-hIFN-α2a的抗病毒增活性；应用流式细胞仪检测SA-hIFN-α2a融合蛋白对膀胱癌细胞MB49细胞的锚定率，初步评价经纯化复性后SA-hIFN-α2a融合蛋白的体外活性。
结果:
1．诱导表达SA-hIFN-α,2a融合蛋白
将质粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a导入大肠杆菌中后，在带有氯霉素和卡钠霉素抗性的平板中经过37℃、16-48h孵育后生长出单克隆菌落，并使菌落过夜活化后37℃、220rpm、0.5mmol/LIPTG条件下诱导表达。经SDS-PAGE鉴定目的蛋白出现在约33KD的位置，经BandScan软件分析，SA-hIFN-α2a目的蛋白约占总蛋白的15％。表达菌通过高压破碎后，SDS-PAGE显示目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。
2．融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG诱导条件的优化
经过SDS-PAGE鉴定，IPTG诱导时间在4h诱导终浓度为0.5mmol/L时为最佳诱导条件。
3．WesternBloting鉴定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表达
将菌体重悬于PBS缓冲液，高压破碎1次(1000MPa)，可达到很好的破菌效果。经洗涤液洗后的包涵体用8M尿素溶解后经过镍柱亲和层析进行分离纯化，目的蛋白被100mmol/L浓度咪唑洗出。经尿素梯度透析复性，复性后的目的条带经SDS-PAGE鉴定融合蛋白的非还原状态主要以多聚体的形式存在，经BandScan软件分析纯度为97％，采用Bradford法测定蛋白浓度为288.96μg/ml。
5．干扰素抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验
通过A549NSV系统鉴定了重组SA-hIFN-α2a融合蛋白对接毒的A549细胞有很好的保护作用，对VSV有明显的抑制效果。我们采用微量细胞病变抑制法，通过A549/VSV系统对重组的SA-hIFN-α2a融合蛋白进行了体外活性测定，其效价约为6.14×107IU/mg；流式细胞仪检测SA-hIFN-α2a融合蛋白对经生物素化的MB49肿瘤细胞锚定率达到98％。
结论:
本文成功的将pET24a-SA-L-hIFN-α2a质粒导入大肠杆菌中并通过诱导表达方法获得大量工程菌和包涵体，通过镍柱亲和层析纯化，尿素梯度复性后经超滤浓缩获得高浓度和高纯度的融合蛋白，并在体外采用抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验中初步证实了SA-hIFN-α2a双功能融合蛋白的生物学活性，为后续的动物实验奠定了基础。