胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤第2位和第3位,严重威胁我国居民的生命健康,是肿瘤预防及控制的重点之一。早期发现和早期诊断是早期治疗的基础,是提高胃癌患者生存期的关键环节。以胃镜为基础的筛查计划使得日本早期胃癌的诊断率提高了3倍,胃癌患者的预后得到有效改善。然而考虑到经济成本效益和人群接受程度,这种筛查方案并未在其他国家推广。近年来,血清胃蛋白酶原、胃泌素17以及其他蛋白类生物标志物备受关注,但其灵敏度和特异度有限,未能得到推广应用。因此,鉴定微创、高效、廉价、易测的新型生物标志物,仍将是提高胃癌防治水平的一个重要研究方向。微小RNAs (microRNAs, miRNAs)作为一类新型的癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生、发展以及转移等方面扮演重要作用,是肿瘤研究领域的热点之一。成熟miRNAs通过与目标mRNA序列结合,导致mRNA的降解或者翻译的抑制,从而调控目标基因的生物学功能。单个miRNA分子能够调控数以百计功能各异的目标基因,因而miRNAs可在生理病理的各个过程中发挥重要的调节作用。靶组织来源的miRNAs在肿瘤临床诊断和预后预测中具有重要的指导意义,成为重要的候选标志物。但是,由于靶组织取样困难,对病人生理和心理创伤较大,在肿瘤的早期筛查中难以应用,且对于晚期非手术患者也不易检测。2008年,国内外研究团队同步发现血浆／血清中广泛存在miRNAs,并且具有含量丰富、性质稳定、易于精确定量检测等诸多特质。近年来,研究结果显示循环miRNAs作为肿瘤生物标志物具有巨大应用前景。胃癌的研究已经报道了其特异表达的循环miRNAs,但是不同研究结果缺乏一致性。例如,有研究报道通过Solexa测序技术筛选出一组胃癌血清差异表达的miRNAs:miR-1、 miR-20a、miR-27a、miR-34和miR-423-5p;另有研究利用miRNA微阵列芯片筛选发现胃癌患者血清中miR-187*、miR-371-5p和]miR-378的表达水平显著高于对照组。这些不一致的研究结果可能与检测平台、样本收集和处理流程以及数据标化方法等有一定的关系,但研究对象的差异,特别是胃癌部位(贲门癌和非贲门胃癌)以及肿瘤分期的差异可能也是产生循环miRNAs研究结果异质性的重要来源。鉴于非贲门胃癌与贲门癌发生机制的差异,以及不同肿瘤分期可能存在循环miRNAs表达差异,本研究以早期非贲门胃癌为切入点,采用四阶段的病例-对照研究设计,筛选并验证了胃癌差异表达的血浆miRNAs。第一阶段,利用TaqMan低密度表达芯片(TaqMan Low Density Array, TLDA)比较40例早期非贲门胃癌患者和40例健康对照混合血浆样本的miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNAs;第二阶段,通过单个样本反转录实时荧光定量PCR (Quantitative Reverse Transcriptase-PCR, qRT-PCR)检测验证第一阶段筛选的差异表达miRNAs;第三阶段,应用qRT-PCR在独立血浆样本中(包括48例早期非贲门胃癌患者、54例胃部良性病变患者和48例健康对照)验证差异表达的miRNAs;第四阶段,应用qRT-PCR检测上述差异表达的miRNAs在不同胃癌部位和不同肿瘤分期血浆样本中(包括早期非贲门胃癌、晚期非贲门胃癌、早期贲门癌、晚期贲门癌和健康对照各18例)的表达情况。在四个阶段的研究设计中,对照均与病例按照年龄和性别进行频数匹配,累计包括124例非贲门胃癌患者、36例贲门癌患者、54例胃部良性病变患者以及106例健康对照。采用Mann-Whitney秩和检验比较对照组与病例组之间血浆miRNAs表达水平的差异。本研究通过TLDA芯片筛选发现了一组早期非贲门胃癌差异表达的血浆miRNAs,并选择了5个表达稳定(在病例或对照中表达CT值低于30)且表达差异4倍以上的候选miRNAs进行后续验证,包括miR-16、miR-25、miR-92a、 miR-451和niR-486-5p;经过第二和第三阶段验证,我们发现这5个miRNAs在早期非贲门胃癌患者血浆中的表达水平均显著高于对照组(所有P<0.05)；第四阶段的验证显示,上述5个miRNAs在晚期非贲门胃癌以及贲门癌患者血浆中也呈现显著高表达(所有P<0.05)。为了评价上述5个miRNAs单独或组合在胃癌诊断中的应用价值,我们基于第二阶段的检测结果(即40对早期非贲门胃癌患者和健康对照)进行参数估计,利用受试者工作特征曲线(Receiver Operator Characteristic Curve, ROC曲线)确定每一个miRNA的最佳诊断界值,应用Logistic回归分析确定每个miRNA在niRNAs组合中的权重,根据miRNA表达值及相应miRNA权重估计每一研究对象的危险分值(RSF),应用这些参数在第三阶段和第四阶段的独立人群中评价5miRNA的诊断价值。第三阶段结果显示,5miRNA miR-92a、miR-451和miR-486-5p)单独诊断早期非贲门胃癌的ROC曲线下面积(Area under the ROC Curve, AUC)分别为0.768、0.694、0.732、0.790和0.779,miRNAs组合的AUC为0.812(灵敏度68.8%,特异度90.2%)。第三阶段与第四阶段合并后的结果显示,5个niRNAs单独诊断胃癌的AUC分别为0.733、0.871、0.817、0.850和0.771, miRNAs组合的AUC为0.909(灵敏度84.2%,特异度91.7%)。为了进一步评价上述5个胃癌差异表达的血浆miRNAs的来源,本研究分别采集了BGC823和MGC803两种胃癌细胞株在不同浓度和不同培养时间点的细胞培养液,应用qRT-PCR检测了5个miRNAs的表达情况。分析结果显示,miR-16、miR-25和miR-92a在两种细胞培养液中的表达水平均随细胞数量和培养时间的增加而升高,而miR-451和miR-486-5p的表达水平均无明显改变,提示胃癌患者血浆中高表达的miR-16、miR-25和niR-92a可能来源于胃癌肿瘤组织,而血浆中高表达的miR-451和miR-486-5p可能并不直接来源于胃癌组织。本研究发现miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p在外周血循环中的表达水平可用于早期胃癌的检测,具有较高的灵敏度与特异度,可作为胃癌早期筛查和诊断的一类新型生物标志物。循环中高表达的miR-16、miR-25和miR-92a可能来源于胃癌组织,而循环miR-451和miR-486-5p的来源有待进一步阐明。本研究的发现有望为胃癌的早期筛查和诊断提供新手段,同时为揭示相关循环miRNAs的分泌机制,以及实现胃癌的早诊早治、促进胃癌的防治奠定基础。