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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定植于猪上呼吸道的条件性致病菌,临床上常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)。由于HPS血清型众多,不同血清型间毒力差异很大,缺乏免疫交叉性,所以至今为止还没有很好的防控副猪嗜血杆菌病的方法。目前国内外学者对HPS致病相关因子进行了诸多研究,发现脂寡糖是潜在的毒力因子之一,可以介导HPS的粘附作用和诱导细胞释放炎性介质。然而与脂寡糖合成相关的基因仍有待深入研究。LgtB/lex-1是HPS基因组上尚待研究的两个基因。在其他菌中已有报道lgtB/lex-1编码β-1,4半乳糖基转移酶,该酶是糖基转移酶家族25(Glycosyltransferase family 25)的成员,参与脂寡糖的合成。因此,本研究旨在分析HPS lgtB/lex-1基因在脂寡糖合成及HPS致病过程中的作用。本研究首先构建了lgtB的缺失突变载体质粒pZQ001和lex-1的缺失突变载体质粒pZQ002,利用自然转化的方法将载体质粒转化亲本菌株HPS SC096分别获得了缺失lgtB基因和lex-1基因的重组菌ΔlgtB株和Δlex-1株;其次构建了互补载体质粒pZQ003和pZQ004,用相同的自然转化方法获得了ΔlgtB-c和Δlex-1-c互补菌株;通过PCR及测序确定菌株构建正确。为了观察lgtB/lex-1基因缺失后脂寡糖的变化,本研究提取了野生菌株和重组菌株的脂寡糖,通过SDS-PAGE及银染等方法进行分析。结果显示ΔlgtB和Δlex-1缺失株的脂寡糖的泳动速度均明显快于野生菌株,表明lgtB/lex-1基因缺失后菌株的脂寡糖分子量变小,脂寡糖链的长度在基因缺失之后变短,说明lgtB/lex-1基因参与脂寡糖的合成。而互补菌株ΔlgtB-c和Δlex-1-c的脂寡糖的泳动速度和野生菌株一致,说明lgt B/lex-1互补成功。本文研究了lgtB/lex-1基因缺失后对菌株抵抗补体介导的血清杀伤作用的影响。结果表明在缺失lgtB/lex-1后HPS的存活率由亲本株的74.92%分别降至15.00%和54.46%,差异显著,这表明两个基因缺失后菌株对抗血清杀伤作用的能力降低;互补lex-1后的菌株存活率与亲本株相比无显著差异,而ΔlgtB-c互补菌株的存活率降为8.51%,和亲本株相比下降了约10倍,差异显著。为了探讨Δlgt B-c互补菌株血清敏感性升高的原因,运用荧光定光PCR方法检测lgtB的表达量,结果发现ΔlgtB-c互补株中lgtB的转录水平是亲本株的27.05倍,说明lgt B基因在互补菌株中表达过量,这种对补体更为敏感的表型可能与lgtB过表达有关。副猪嗜血杆菌致病的重要机制之一是粘附和入侵宿主细胞。因此本研究测定了ΔlgtB和Δlex-1缺失株对猪肾上皮细胞(PK-15)的粘附和入侵能力。结果表明和野生型菌株相比,ΔlgtB、Δlex-1缺失株的粘附和入侵能力都有显著的下降,意味着lgtB/lex-1基因缺失后会导致菌株粘附入侵宿主细胞的能力下降。最后,本研究用ΔlgtB缺失株通过腹腔接种的方式感染250g左右健康普通级豚鼠,并与亲本株SC096比较毒力差异。结果显示感染SC096组豚鼠出现食欲、饮水量下降,精神不振,被毛粗乱、呼吸困难等临床症状,但感染ΔlgtB缺失株组豚鼠无明显临床症状;感染SC096组豚鼠腹腔中有较多纤维素性渗出液,肝脏、胃,小肠表面都出现白色纤维素渗出,而感染ΔlgtB缺失株组豚鼠无明显眼观病理变化,腹腔内没有出现纤维素性渗出物。结果表明ΔlgtB缺失株与其亲本株SC096相比,毒力有明显减弱。