花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究

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花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)属鞘翅目寄甲科昆虫,作为一种重要的天敌生物,已被广泛应用于天牛类害虫的生物防治。细胞色素P450是昆虫三大解毒酶之一,在昆虫对多种化学杀虫剂的解毒代谢过程中发挥重要作用。随着化学农药的大量使用,药剂在杀死害虫的同时,对天敌昆虫也有较大影响。关于农药对害虫的影响、害虫对农药的解毒代谢机制有较多的相关报道,但关于蛀干害虫的天敌——花绒寄甲对农药胁迫的响应机制未见相关报道。本文首先探究了常用杀虫剂氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力;其次利用转录组测序技术筛选出花绒寄甲在氯氰菊酯药剂处理下高表达的P450基因,再同时借助实时荧光定量技术检测不同浓度氯氰菊酯处理后花绒寄甲相关P450基因表达差异,最后使用RNAi技术验证相关P450基因的功能,为后续探究花绒寄甲对氯氰菊酯的解毒代谢过程奠定基础。主要试验结果如下:1、利用浸渍法,获得氯氰菊酯对花绒寄甲的击倒中浓度KC50为0.19 mg/L,KC30为0.08mg/L。被击倒后的花绒寄甲胸足抽搐,无法正常爬行和取食。花绒寄甲对氯氰菊酯的耐受性较好,只有在较高浓度的氯氰菊酯处理下才会出现死亡。2、利用氯氰菊酯KC30药剂浓度和丙酮浸渍处理花绒寄甲成虫,提取处理后24h的总RNA,构建cDNA文库,利用Illumina技术进行测序,获得相应转录组数据。以|log2(Fold Change)|>0为标准,共筛选出90条差异表达的P450基因,其中有57条基因表达量升高,最高的差异倍数为39.4倍;有33条基因的表达量下降,最高下降了7.5倍。3、从转录组数据中筛选出差异表达的12条P450基因,利用实时荧光定量技术检测花绒寄甲在氯氰菊酯KC10、KC30浓度处理下,1h、4h、8h、12h、24h、48h时基因的表达差异,结果表明:花绒寄甲在受到药剂胁迫后,这12条基因的表达量在各时段内均有上升,在8h-24h内,基因表达量上升最明显的分别是:农药处理8h时,基因Dh 1216的表达量是对照组的9倍,处理12h时,基因Dh 775的表达量是对照组的9倍,处理24h时,基因Dh 1094的表达量是对照组的5倍。4、利用RNAi技术,向花绒寄甲体内注射不同注射量、不同P450基因的dsRNA,结果发现:对花绒寄甲的P450基因进行单一干扰时,基因Dh 775的表达量下降最明显,下降了77.0%;基因Dh 1094的表达量下降最小,下降了47.3%;当两条基因或三条基因混合干扰时,在一定注射量范围内,基因表达量会随dsRNA注射量的增加而降低。干扰基因Dh 1094后,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性变化最为明显,用KC50浓度处理24h时,击倒率上升至96.7%。单一干扰基因Dh 775、Dh 1216后,击倒率分别上升至68.2%、73.7%。混合干扰中,干扰基因相同的情况下,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性会随着注射量的增多而升高。因此推测花绒寄甲的三条P450基因:Dh 1216、Dh775、Dh 1094与其对氯氰菊酯的解毒代谢功能相关。
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