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肥胖是一种常见的能量代谢性疾病,其检出率逐年增高,已成为全球性的流行性疾病。肥胖与2型糖尿病、高血压、心脑血管疾病等关系密切,是2型糖尿病等严重并发症发生发展的高危因素。由于近年来肥胖与2型糖尿病发生的低龄化趋势日趋突出,儿童与青少年肥胖与2型糖尿病之间的关系也开始受到儿科学者的关注。脂肪组织在体内过度积聚是肥胖的重要特征,胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能障碍则是2型糖尿病最主要的两个病理生理学变化。长期以来,研究者一直试图阐明肥胖与2型糖尿病之间的关系,拟以脂肪细胞分泌的细胞因子,如:游离脂肪酸(Free Fatty Acids,FFA)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)、Leptin、Adiponectin等,来解释胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能障碍的发生发展,但均未获满意结果。Resistin,是近年来通过差减杂交实验发现的、由脂肪细胞分泌的胰岛素抵抗候选分子。由于:1)饮食性或遗传性肥胖小鼠血浆Resistin浓度明显升高,禁食或TZDs类抗糖尿病药物应用后其血浆浓度明显降低;2)重组Resistin能使正常小鼠出现明显的胰岛素抵抗症状,而应用Resistin中和抗体则能显著改善胰岛素抵抗的症状,因此Resistin被认为是联系肥胖与2型糖尿病的纽带。胰岛素抵抗涉及骨骼肌、脂肪、肝脏、胰岛等多个重要靶组织的功能变化。有关Resistin与骨骼肌、脂肪细胞胰岛素抵抗关系的研究,近年来已有较多文献报道,但对肝脏、胰岛功能影响的研究却并不多见,具体表现在:1)尽管有报道指出Resistin可严重影响肝细胞的糖代谢,但Resistin与肝细胞胰岛素抵抗之间的关系及其具体机制却并不清楚;2)葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose stimulated insulinsecretion,GSIS)功能低下、胰岛β细胞凋亡是构成胰岛β细胞功能障碍的两个重要方面,尽管目前研究证实Resistin可引发胰岛细胞的GSIS功能障碍,但尚未见有关Resistin与胰岛β细胞凋亡关系的研究报道。本研究分别以大鼠肝细胞H4IIE、大鼠胰岛β细胞株RINm5F为研究工具,以初步阐明Resistin与肝脏胰岛素抵抗、Resistin与胰岛β细胞凋亡之间的关系。采用饮食诱导的肥胖大鼠和3T3-L1前体脂肪诱导分化来初步探讨Resistin的分泌。第一部分Resistin对H4IIE肝细胞胰岛素敏感性的影响及其机制目的:观察Resistin对肝脏胰岛素敏感性的影响,并初步探讨其机制。方法:1)体外培养大鼠H4IIE肝细胞株,以重组Resistin蛋白干预H4IIE肝细胞,通过检测胰岛素刺激的糖原合成,评估肝细胞胰岛素敏感性的变化;2)以Resistin干预的H4IIE肝细胞为研究对象,采用Western Blot技术测定胰岛素受体后信号转导途径中IRS-1、Akt、GSK-3β的总蛋白水平和磷酸化水平,采用RT-PCR、Western Blot技术检测IRS负性调节因子SOCS-3的mRNA水平、蛋白水平,初步分析Resistin影响肝细胞胰岛素敏感性的机制;3)体外合成SOCS-3特异的ASO(anti-sense oligo),转染H4IIE肝细胞株以抑制SOCS-3的表达,以重组Resistin蛋白干预转染有SOCS-3特异ASO的H4IIE肝细胞,通过检测胰岛素刺激的糖原合成,验证SOCS-3在Resistin致肝细胞胰岛素敏感性变化机制中的作用。结果:1)Resistin对胰岛素刺激的肝细胞糖原合成具有抑制作用;2)Resistin抑制肝细胞中IRS-1、Akt、GSK-3β的活性,对IRS-Akt-GSK3整条信号转导通路具有抑制作用;3)Resistin上调肝细胞中IRS负性调节因子SOCS-3的mRNA水平、蛋白水平,SOCS-3特异ASO的应用能显著改善Resistin对胰岛素刺激的肝细胞糖原合成的抑制作用。结论:1)Resistin可降低肝细胞的胰岛素敏感性,诱导肝细胞胰岛素抵抗;2)Resistin可能通过激活SOCS-3的机制,抑制胰岛素受体后信号转导途径的作用,导致肝细胞胰岛素抵抗。第二部分Resistin对大鼠胰岛β细胞功能的影响目的:探讨Resistin对胰岛β细胞功能的影响,评价凋亡抑制蛋白TIMP-1在逆转Resistin致胰岛β细胞凋亡中的作用。方法:体外培养RINm5F大鼠胰岛β细胞株,以重组Resistin蛋白或/和TIMP-1干预RINm5F胰岛β细胞,MTT法检测细胞活性,以Caspase-3活性、DNALadder等凋亡特异性检测指标鉴定细胞凋亡,Western Blot检测IκB-α总蛋白和磷酸化水平。结果:1)大剂量(200ng/ml)Resistin能显著降低RINm5F胰岛β细胞的细胞活性,TIMP-1则能逆转由Resistin引起的RINm5F胰岛β细胞活性降低;2)Resistin诱导RINm5F胰岛β细胞凋亡,TIMP-1则对Resistin诱导的胰岛β细胞凋亡具有拮抗作用;3)Resistin能显著上调IκB-αser32位点的磷酸化活性,TIMP-1则能抑制IκB-αser32位点磷酸化活性的上调。结论:1)Resistin可影响胰岛β细胞的功能,具有诱导RINm5F胰岛β细胞凋亡的作用;2)Resistin可能通过上调IκB-αser32位点磷酸化活性的机制,诱导胰岛β细胞凋亡;3)TIMP-1可能够通过抑制IκB-αser32位点磷酸化活性的机制,拮抗Resistin对RINm5F胰岛β细胞凋亡的诱导作用。第三部分3T3-L1脂肪细胞与饮食诱导肥胖大鼠Resistin的分泌目的:初步探讨影响Resistin分泌的调节因素。方法:1)体外培养3T3-L1前体脂肪细胞株,诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,于3T3-L1前体脂肪细胞分化过程的第0、4、6、8天收集细胞培养的上清;2)以高能量饲料诱导SD大鼠,制备饮食诱导的肥胖大鼠模型,模型制备成功后采集大鼠血清;3)ELISA法检测细胞培养上清、大鼠血清中的Resistin水平。结果:1)随3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化,细胞培养上清中的Resistin分泌量逐渐增加;2)肥胖大鼠血清中的Resistin水平显著高于正常对照大鼠。结论:1)脂肪细胞分泌Resistin的水平与脂肪细胞的成熟度有关;2)Resistin的分泌与机体的营养状态有关。