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目的 众所周知，肿瘤的发生可能是多种基因突变积累的结果。目前已经确定有很多基因参与了细胞的恶性转化和癌进展过程，这些研究多集中于核基因。近年来线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)成为肿瘤学研究的热点之一，它是核基因组之外的一种重要的DNA物质，比核基因更容易受多种致癌因子的影响而发生突变。 肿瘤相关的基因突变如何确定并能应用于临床诊断是我们所面临的重要课题。近年来发现，在体液中可以检测到肿瘤细胞核DNA，但由于数量较少，以及正常DNA的稀释作用，检出率较低。mtDNA区别于核DNA的特点有两个：其一，它缺乏损伤修复机制，可能会先于核DNA而受到环境因素的影响并持续存在；其二，mtDNA数量多，复制率高，可能更易于检测。那么通过检测体液中的肿瘤DNA组分，可以作为肿瘤的检测、诊断或评价的手段。mtDNA在这方面可能具有潜在的优势。 HV1位于线粒体DNA非编码调控区，mtRNA的转录和翻译受核DNA的调控，通过线粒体非编码区起作用，目前已知的较多的突变多集中于HV1区，它可能是核基因对线粒体基因的调控枢纽，其本身也易受环境影响而突变，因此与肿瘤发生关系密切。 本实验分为三部分，研究目的在于：1．对胃癌和膀胱癌组织mtDNA调控区的HV1区(mtDNA 16024-16383)进行突变检测，研究恶性肿瘤组织是否存在HV1基因突变及其意义。2．对膀胱癌和胃癌患者血浆和尿液中mtDNA的调控区的高变区HV1区进行突变检测，与组织的检测结果进行对比，探讨体液诊断的意义及可行性。3．平行检测体液中P53突变，对体液中mtDNA与核基因突变检测的诊断价值进行比较。 方法 一．实验材料 主要仪器：MJ PCR扩增仪、离心机(FISHER)、琼脂糖电泳仪(GIBCO BRL)、分光光度仪(BECKMAN)、电子分析天平(BIO-RAD)、恒温水浴箱、基因突为电泳检测仪（D GENE）、DNA自动测序仪（ABI PmSM—377XLDM Se叩encer）。 材料与试剂：GOLD Taq聚合酶（ROCHEX酚醇试剂＊2InM dNTP混合液（Q既OB ee厂纯去离子水J0％过硫酸铰、四甲基乙烯二胺（mMEDX琼脂糖、丙烯酷胺、上样缓冲液、PCR缓冲液。 二．实验方法 ＊标本：肿瘤组患者 60例，其中膀耽癌患者 30例人期 9例人期历例几期 5例。胃癌患者 30例。11期 3例，皿期 18例＊期 9例。手术前取静脉血10rnl，EDTA抗凝，离心法分离细胞与血浆成份，膀耽癌患者同时取晨尿50ml与血浆保存于一20℃。获得的淋巴细胞保存于一80℃。所有肿瘤组织标本均于手术中切取，约 0．5 x 0．5 x 0．scm大小，立即保存于液氮中。胃癌组织病理均为腺癌，膀耽癌组织病理诊断为移行细胞癌。对照组：非癌胃粘膜30例与膀耽粘膜组织各30例，及其相应自身淋巴细胞按上述方法提取并保存。 2．DNA的提取：组织的DNA提取采用标准的酚醇抽提法。自身对照的淋巴细胞DNA提取采用WIZAED kit提取液（Promegs，France人血浆和尿液中的 DNA提取应用 QLAmP Blood Kit（Qiagen，France）提取液／ ml血浆可获得大约50glDNA。 3．PCR扩增： HVI弓物：5”－CACCAI’tt＊xGCACCCAAAGCT—3 u 5”一 TGMACG－GAGGATGGTG－3”。PCR过程35个循环，95t30s，55℃305，72t60s。 P53弓物：第 5夕显子：5”一 AG删删ACTI’GteCCC皿Cn和 5”一GAGGAATCAGAGGCCTGGG；第 6夕显子：5”一 TGCCCCAGGCCTCTGAI’tm和5”－CATCGAA皿CACTGACAACCACCCn；PCR扩增40个循环，每个循环95℃ 30s，63℃二dnt70℃ lmin。 4．SSCP法变异片断的筛选：PCR产物取 10gi，加 20gi变性上样液，98℃变性10ndn，立即放人冰水中smin以上。电泳采用10％聚丙烯酞胺凝胶电泳，体系温度控制在20 t，时间3 h。胶片银染，观察结果。 5．突变片断的测序：样品纯化后测序，测序仪为 ABI PMSM”377XLDNA SeqUencer（大连宝生物公司八测序引物与 PCR引物一致。 6．统计学采用方差分析和卡方检验。 ·2· 结 果 1．组织中mtDNA突变的检测：SSCP结果发现13例肿瘤组织HVI基因突变，包括 7例胃癌组织 （7／3，23．3％）和 6例膀腕癌组织K／30，20％八所有正常组织均不存在突变。突变率恶性肿瘤组织与正常对照间差异有显著统计学意义仲＜0．of人 2．测序结果：样品测序结果显示产物大小为413hp，与Genebank中mi－tomaP对照，扩增区为16008－16420区，包含了HVI 区（16024－16383）。选3例已知突变的癌组织（G6、G27和m）进行测序。结果发现，二例胃癌组织（G6）存在16208G－C点突变，另1例胃癌（G27）存在16171－16181的 11个冲的删除突变。1例膀眺癌山）存在 16309A－T点突变。 3．HVI突变在血浆和尿液中检测结果的比较：结果发现，7例胃癌患者血浆中3例发现与组织一致的泳带，占42．9％。6例膀腕癌患者2例p3．3％）从血浆中扩增出HV片断，且与组织中一致，5例u3．3％）尿样结果与组织中一致。 4．体液检测结果与肿瘤分期的?