溃疡性结肠炎(UC)是一种直肠和结肠粘膜的炎症疾病，病因尚不明确，是易感基因、环境和免疫系统等相互作用导致的复杂疾病，免疫系统的参与在UC的病机发展中起重要作用。随着免疫学、分子生物学等学科的迅速发展，以及近年来对细胞因子、粘附分子的研究，尤其是核因子-κB(NF-κB)及Toll样受体(TLRs)的研究，UC的发病机制正逐步得以揭示，TLRs／NF-κB通路的部分阐明也为寻找UC的治疗提供了新的契机，通过抑制此通路的关键分子进而阻断UC过激的炎症反应已成为众多学者研究的方向。中医药在UC的治疗上有不可轻视的疗效，中医药治疗UC的实验研究尤作用机理的研究是目前中医药治疗UC的重点。脾胃研究所在多年临床经验的基础上，以清热健脾活血为治则，总结出治疗UC的溃结灵复方(K，D)，临床取得了较好的疗效，无明显毒副作用。前期研究采用三硝基苯磺酸法(TNBS)制作UC大鼠模型，发现KD能明显减少UC大鼠结肠溃疡个数和面积，改善结肠粘膜炎症和水肿等病理变化，因此KD对TNBS法UC大鼠模型有较好的治疗作用，同时KD能降低模型大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α的含量和结肠组织中NF-κBp65蛋白的阳性细胞率，对模型大鼠肠粘膜TLR2、TLR4基因表达也有抑制作用。本研究拟从细胞因子、粘附分子表达的源头TLRs／NF-κB通路入手，观察KD对此通路的一些关键环节TLR2、TLR4、NF-κB及其中间环节IκB-α、IKK-α和下游细胞因子TNF-α、IL-1β、粘附分子ICAM-1的作用，探讨KD治疗UC的深层次作用机理。这一研究将使中医药治疗UC的机理研究深入到基因调控水平，并为开发高质量的抗UC中药新药打下坚实的基础，有重要的理论意义和广阔的应用前景。1 KD对UC大鼠结肠粘膜中IL-1β、TNF-α的作用细胞因子尤其是促炎因子在UC的发病及进展中起到了重要的作用，其中IL-1β和TNF-α最具代表性。本研究观察KD对UC大鼠结肠粘膜中IL-1β、TNF-α的作用，对其作用机制进行初步探讨。KD采用中、高剂量对TNBS法UC大鼠模型进行治疗，治疗结束采集结肠粘膜标本，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测结肠粘膜中IL-1β、TNF-α的含量，并进行统计学分析。结果表明模型组结肠粘膜中TNF-α和IL-1β的含量分别为99.35±36.67 pg／mL和160.90±51.78 pg／mL，明显高于正常组(分别为33.06±10.97 pg／mL和35.64±11.17 pg／mL，P＜0.01)。KD高剂量组结肠粘膜样本中TNF-α的含量为40.66±6.58pg／mL，明显低于模型组(P＜0.01)；KD高、中剂量组结肠粘膜样本中IL-1β的含量分别为67.30±32.57pg／mL和69.32±31.24pg／mL，明显低于模型组(P＜0.01)。提示KD能够降低UC大鼠结肠粘膜中促炎因子IL-1β、TNF-α的含量，这可能是其治疗UC作用的机理之一。2 KD对UC大鼠结肠粘膜ICAM-1基因表达的作用近年来，粘附分子与UC的关系越来越受到人们的重视，其中尤以细胞间粘附分子(ICAM-1)与UC的活动和转归关系密切．本研究观察KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜ICAM-1基因表达的作用，探讨其作用机制。大鼠随机分为以下六组：正常组、模型对照组、KD低、中、高三个剂量组和阳性药SASP组。治疗十天后处死大鼠并采集结肠粘膜标本。用Trizol提取总RNA，采用RT-PCR法检测ICAM-1的基因表达，以β-actin作为内参，产物进行凝胶电泳分离，用凝胶成像仪自带分析软件进行灰度分析，以ICAM-1与β-actin的灰度值比值作为ICAM-1基因的相对表达量，进行组间比较分析。结果表明模型组ICAM-1基因相对表达量是1.044±0.180，明显高于正常组(0.359±0.119，P＜0.01)；KD中剂量组ICAM-1相对表达量为0.797±0.210，明显低于模型组(P＜0.05)，KD高剂量组和阳性药SASP组ICAM-1相对表达量分别是0.555±0.184和0.635±0.242，明显低于模型组(P＜0.01)。提示KD对TNBS法UC大鼠结肠粘膜ICAM-1基因表达有抑制作用，这可能是其抗UC作用的机理之一。3 KD对UC大鼠结肠粘膜NF-κB p65的DNA结合活性的作用TNF-α、IL-1β及ICAM-1的表达与NF-κB的活化密切相关。本研究在前面研究的基础上，对结肠粘膜NF-κB P65DNA结合活性进行检测。分组和治疗同前述，治疗结束后处死大鼠并取新鲜结肠粘膜标本提取核蛋白，利用以ELISA为基础的Trans AM TM NF-κB p65试剂盒检测NF-κB p65的DNA结合活性，并进行统计学分析。结果表明模型组结肠粘膜NF-κB相对活性为0.440±0.119，明显高于正常对照组(0.261±0.042，P＜0.01)；KD高剂量组和阳性药SASP组结肠粘膜NF-κB相对活性分别为0.261±0.056、0.269±0.106，均明显低于模型组(P＜0001)。提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜NF-κB活性明显降低，这可能也是其治疗UC作用的机理之一。4 KD对UC大鼠结肠粘膜TLR2、TLR4蛋白水平的作用TLRs是NF-κB激活的TLRs／NF-κB通路的重要环节，TLRs对肠腔内病原模式识别分子(PAMPs)进行模式识别，经一系列信号传导分子最终促发NF-κB核因子的激活。本研究观察了KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜TLR2、TLR4蛋白水平的作用，对其作用机制进行探讨。分组和治疗同前述，治疗结束后采集结肠粘膜标本并提取全细胞蛋白，运用蛋白免疫印迹(Western blot)方法对TLR2和TLR4的蛋白表达水平进行检测，以β-actin作为内参，以目的蛋白与β-actin的密度比值作为目的蛋白的相对含量，进行组间比较分析。结果模型组TLR2、TLR4蛋白相对表达量分别是0.663±0.137和0.843±0.201，均明显高于正常组(分别为0.254±0.052、0.472±0.072)(P＜0.01)：KD中、高剂量组TLR2相对表达量分别为0.472±0.160和0.376±0.104，明显低于模型组(P＜0.05和P＜0.01)；KD高剂量组TLR4相对表达量为0.620±0.178，明显低于模型组(P＜0.05)。提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜TLR2、TLR4蛋白表达有抑制作用，这可能是其抗UC作用的机理之一。5 KD对UC大鼠结肠组织IκB-α、IKK-α蛋白表达的作用IκB-α、IKK-α是TLRs／NF-κB通路的中间环节，IκB的磷酸化是激活NF-κB系统的关键步骤，IKK的活化是NF-κB激活途径中的限速步骤。TNBS所致大鼠UC的发生与NF-κB的活化及TLR2、TLR4蛋白的高表达密切相关，KD对UC大鼠模型过度激活的NF-κB和过度表达的TLR2、TLR4蛋白水平有下调作用，在此基础上本研究对UC大鼠结肠组织IκB-α、IKK-α蛋白表达进行检测，以期对KD治疗UC的较深层次的作用机理进行探讨。分组和治疗同前述，治疗结束后取结肠组织固定，切片进行免疫组化染色，光镜下分别计数IκB-α和IKK-α阳性细胞表达率，并进行统计学分析。结果模型组结肠组织IκB-α、IKK-α蛋白阳性细胞表达率为36.3±11.9％和35.3±12.0％，明显高于正常对照组(分别为14.8±5.1％和11.0±4.4％，P＜0.01)；KD高剂量组结肠组织IκB-α蛋白阳性细胞表达率为26.2±8.6％，明显低于模型组(P＜0.05)，KD中剂量组结肠组织IKK-α蛋白阳性细胞表达率为25.3±7.0％，明显低于模型组(P＜0.05)，KD高剂量组和阳性药SASP组结肠组织IKK-α蛋白阳性细胞表达率分别为20.2±6.0％和22.3±6.2％，明显低于模型组(P＜0.01)。提示KD对TNBS法UC大鼠模型结肠组织IκB-α、IKK-α蛋白阳性细胞率明显降低，这可能是其治疗UC作用的机理之一。总之，TLRs／NF-κB通路在UC的发生发展中占举足轻重的地位，NF-κB对UC发病的关键性细胞因子如TNF-α、IL-1β等和ICAM-1有调控作用，从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应。当上游刺激因子如TNF-α、IL-1β等与TLRs结合，TLRs向细胞内传递活化信号，激活NF-κB，进而调节炎症递质的产量，导致UC炎症粘膜的损伤。NF-κB活化后会产生持续扩大的炎症反应，使病情不断进展。对TLRs／NF-κB通路中的关键环节NF-κB、TLRs及其中间环节IκB-α、IKK-α和上(下)游分子TNF-α、IL-1β、ICAM-1进行干预，可以有效地阻止UC的进程，达到治疗目的。本研究选用清热健脾活血中药复方KD治疗大鼠实验性UC，取得较好的治疗效果，结果表明：KD能明显降低模型大鼠结肠粘膜中TNF-α、IL-1β含量，下调模型大鼠结肠粘膜ICAM-1基因表达和NF-κBp65DNA结合活性，降低模型大鼠结肠粘膜TLR2、TLR4蛋白表达水平，降低模型大鼠肠粘膜组织IκB-α、IKK-α蛋白阳性细胞表达率。这些研究结果说明，KD对TLRs／NF-κB通路的多个环节均有干预作用，这可能是其治疗UC作用的部分机理。