下丘脑orexin神经肽系统是睡眠/觉醒周期的重要调控者,其缺陷也导致多种形式的运动障碍。运动功能由神经系统中众多运动结构协调控制完成,大量的研究已经表明,orexin能神经系统对这些运动结构均有直接的纤维投射,提示orexin能神经系统可以通过对它们直接的作用参与运动调控,然而具体的神经通路机制及功能,以及相关的生理意义及其与orexin缺陷导致的运动障碍发病机制之间的关系,都还很不清楚。已有研究表明,在orexin全基因敲除动物的脑桥中导入orexin基因,可以显著改善orexin缺失导致的疾病症状,包括其运动障碍症状。该结果提示脑桥可能是orexin调控运动功能的重要靶点。脑桥中存在一系列参与运动控制的功能核团,包括脑桥尾侧网状核（caudal pontine reticular nucleus,PnC）以及背外侧被盖底核（sublaterodorsal tegmental nucleus,SLD）等。PnC中的兴奋性网状脊髓神经元在觉醒期促进躯体肌张力升高,是此时机体维持姿势的核心因素之一;SLD则与快速眼动睡眠（Rapid eye movement,REM）时正常的肌张力迟缓（muscle atonia）现象密切相关。有意思的是,在orexin缺陷的人或动物不仅存在觉醒期肌张力突然缺失而导致的猝倒（cataplexy）运动障碍,其REM睡眠期的肌张力迟缓状态也受到严重损害,常表现出REM期肌张力异常亢进而致梦境运动行为,被称为快速眼动睡眠行为障碍（rapid eye movement behavior disorder,RBD）。本课题组及其他多个研究者先前的工作也已发现,orexin能神经纤维投射到达PnC和SLD,且orexin确可影响这些脑区的神经元活动,提示orexin能神经系统可能通过这些脑区,对肌张力有复杂的调控模式,因此需要在整体行为背景中,分别对orexin能神经系统投射到PnC和SLD的神经通路的形态和活动特征、相关细胞/分子层面机制、以及具体生理功能意义,展开深入研究。本课题首先关注了下丘脑投射到PnC的orexin能神经通路,并首先采用神经束路示踪明确其形态学特征;在此基础上联合采用电生理学、光纤钙成像、运动行为学、光/化学遗传学以及微透析等技术手段,详细解析了这些神经通路对肌张力调控效应以及功能意义。此外在课题组其他研究也已明确下丘脑-SLD orexin能神经通路形态和活动特征的基础上,对下丘脑orexin-SLD神经通路调控肌张力的功能意义也进行了探索。主要结果如下:1.下丘脑orexin-PnC神经通路的构筑特征及生理学作用（1）特异性投射至PnC的orexin能神经元弥散分布于下丘脑外侧区为明确下丘脑-PnC的orexin能神经通路形态学特征,我们首先采用逆行束路追踪技术,通过在单侧PnC中微量注射CTB Alexa Fluor?555,标记了投射至PnC的神经元。同时,我们也在同一侧的前庭外侧核（lateral vestibular nucleus,LVN）注射CTB Alexa Fluor?488,同步标记投射至LVN的神经元。逆行追踪标记神经元后,通过免疫组织化学染色技术可特异标记其中的orexin能神经元,结果显示确有orexin神经元直接投射至PnC区域,且并未发现这部分orexin能神经元有特异性聚集表达的区域,而是较为弥散地平均分布。为进一步定量分析这些投射至PnC的orexin能神经元的分布特征,我们沿纵轴方向,由尾端至头端覆盖orexin能神经元所定位的下丘脑区域,等间距（200μm）地收取4个冠状切面进行了统计分析。结果显示整体的orexin能神经元,在从尾端至头端的4个位面中的计数数量分别为59.5±5.5、70.5±14.1、144.0±32.9、144.3±42.5（n=4）,而同样的每一切面中,特异性投射到PnC的orexin能神经元数量分别为9±3、11.3±2.0、20.8±2.4、18.8±5.3（n=4）,表明这些orexin能神经元与整体orexin能神经元在纵轴方向的分布趋势较为一致。分析特异性投射到PnC的orexin能神经元占比则表明,在CTB注射位点同侧有17.7±7.8%的orexin神经元投射到PnC,而在注射位点对侧这一比例则为12.3±4.3%,统计分析未发现orexin能神经元对PnC进行投射的同/对侧比例有明显差异（n=4,P>0.05）。为进一步确定投射到PnC的orexin能神经元的特异性,我们用投射到LVN（另一脑干肌张力调控中枢）的orexin神经元进行了对比分析。结果表明,在4只双位点逆行束路追踪的小鼠下丘脑,我们计数到6.8±0.9%的orexin能神经元投射到LVN（n=4）,且它们也在下丘脑弥散地平均分布,而同时计数到14.4±1.0%的orexin能神经元投射到了PnC（n=4）,更为有意思的是,这两部分orexin能神经元几乎不存在重叠,同时投射到这两个脑区被双标的orexin神经元占比仅为1.7±0.3%（n=4）,提示投射到PnC的这部分orexin能神经元很可能构成具备独特功能的亚群。（2）Orexin能纤维末梢和受体广泛分布于PnC区域在对PnC区域进行免疫组织化学荧光染色后,我们也仔细分析了该脑区中orexin能神经纤维形态特征,结果显示在PnC中orexin能神经纤维呈曲张体样分布;相应的orexin受体也在PnC神经元上丰富表达。进一步研究发现表达orexin能受体的神经元大部分为谷氨酸能神经元,而且细胞直径均大于35μm。（3）光遗传学激活PnC中orexin能纤维末梢引起PnC神经元兴奋性反应为了分析orexin-PnC通路的活动是否会对PnC神经元产生影响,我们利用离体膜片钳结合转基因杂交动物orexin-Cre:Ai27D小鼠开展了脑片膜片钳实验。Orexin-Cre:Ai27D小鼠由orexin-Cre小鼠和Cre酶依赖表达Ch R2-td Tomato融合蛋白的报告小鼠杂交而来,前期免疫组织化学荧光染色已证实出生8-14天后,该小鼠orexin能神经元已经大量表达Ch R2-td Tomato融合蛋白。因此在脑片膜片钳实验中,我们通过在荧光显微镜下观察到PnC脑区有td Tomato荧光显示的orexin能纤维末梢情况下,通过蓝光照射（473 nm,20 Hz,5 ms pulses,5 s）对其进行激活后,观察钳制的PnC神经元上膜电位反应,结果发现可引起一个去极化反应,表明orexin-PnC神经通路的活动确能影响PnC神经元的活动。2.下丘脑orexin-PnC神经通路的肌张力调控效应（1）光遗传学激活PnC中orexin能神经纤维末梢促进运动调控功能在解析了orexin-PnC神经通路特征的基础上,我们通过光遗传学方法表达Ch R2并特异性激活这一通路研究其对肌张力的在体调控作用。我们在动物进行加速rota-rod运动行为（4-40 rpm,180 s）测试过程中,通过随机选取重复试验,在动物执行运动行为时进行PnC区域orexin能神经元纤维末梢的光遗传学激活（473 nm,20 Hz）,并与对照重复试验时动物的运动时长进行比较发现,orexin-PnC通路的激活显著增长了动物在加速rota-rod运动中的掉落时间（对照:106.90±14.41 s,蓝光照射:125.49±7.49 s,n=6,P<0.05）,表明该通路的激活促进了PnC介导的运动调控功能。（2）下丘脑orexin-PnC神经通路促进运动调控的在体活动基础为明确orexin-PnC神经通路促进运动调控的功能是否在正常在体情况下发生,我们通过光纤钙荧光信号记录,首先观察了特异投射至PnC的orexin能神经元(orexinPnC)在动物进行加速rota-rod运动时的活动情况。结果显示,在加速rota-rod运动一开始后,orexinPnC神经元的钙荧光信号即快速、大幅度上升,并在动物整个运动期维持在较高的水平(运动开始前500 ms平均钙信号水平:0.54±0.12%,运动起始阶段峰值钙信号水平:6.52±1.24%,PCtrl vs Peak<0.01,运动持续期间平均信号水平:2.86±0.38%,PCtrl vs Lasting<0.01)（n=5）,且常在基线水平上出现钙信号峰。该结果表明orexin-PnC神经通路促进运动调控的功能很可能在正常加速rota-rod运动时即可发生。（3）光遗传学抑制下丘脑-PnC orexin能神经通路在体活动降低了肌张力调控随后通过光遗传学方法表达Arch T并特异性抑制这一通路的结果显示,加速rota-rod运动中通过589 nm黄光持续抑制这一通路确实降低了动物的掉落时间（无光照:49.95±5.07 s,黄光照射:42.58±9.33 s,n=6,P<0.05）,表明orexin-PnC神经通路的内源性活动确可促进运动调控功能。进一步的爪抓力测试表明,光遗传学抑制orexin-PnC神经通路的内源性活动是通过降低PnC介导的肌张力控制（无光照:125.49±7.49 gf,黄光照射:106.90±14.41 gf,n=6,P<0.05）,实现对运动调控的影响。3.下丘脑orexin-PnC神经通路促进肌张力的功能意义（1）正性情绪增强下丘脑orexin-PnC神经通路在调控肌张力过程中的活动为明确orexin-PnC神经通路活动促进肌张力的功能意义,我们进一步对其在体活动进行了观察。通过光纤钙荧光信号成像技术,我们首先发现orexinPnC神经元的钙荧光信号在动物被巧克力诱发的正性情绪时,会显著升高（进食前500 ms信号均值:3.29±1.13%,进食时500 ms信号均值:9.67±2.47%,n=4,P=0.022）。这一现象提示,orexinPnC神经元很可能接受正性情绪调控,并将其整合到调控肌张力时的活动中。我们随后通过建立正性情绪与运动功能之间的操作式条件反射对这一可能性进行了直接验证,结果显示,在动物建立好红光环境下平衡木（balance beam）运动与巧克力奖励相关的操作式条件反射后,此环境的平衡木运动中orexinPnC神经元确实表现出更强水平的钙荧光信号增长（无红光环境:100±32.21%,红光环境:124.56±40.19%,n=4,P=0.023）。考虑到orexin缺陷导致的肌张力突然消失的猝倒症状常由正性情绪诱发,这一结果强烈提示了orexin-PnC神经通路在正性情绪下运动过程中的活动对于此时的肌张力调控有重要意义,缺失就可能导致猝倒症发生。（2）Orexin-KO动物PnC中长时程微透析orexin可减少猝倒发作通过微透析给药方法,为orexin-KO模型小鼠的PnC长时程补入orexin后,长时间观察了在正性情绪诱发物存在的情况下对行为影响,EEG-EMG监测结果则显示,基因敲除小鼠的猝倒样发作频率显著减少（orexin:0.23±0.11次/h,ACSF:0.87±0.3次/h,n=6,P<0.01）,发作的持续时间也明显降低（orexin:20.1±10.6 s/h,ACSF:86.2±21.2 s/h,n=6,P<0.01）,表明局限于PnC中的orexin补充即可挽救猝倒症。4.下丘脑orexin-SLD神经通路调控肌张力的功能意义（1）下丘脑orexin-SLD神经通路对肌张力的下调功能特定影响REM睡眠稳定本部分实验在课题组先前其他研究工作的基础上,首先观察了orexin-SLD神经通路对SLD介导肌张力控制功能的可能影响。结果发现通过神经药理学方法观察orexin对SLD调控的行为学效应。对于每次抓杆中的最大肌张力（maximal force,MF）进行了分析发现orexin可显著抑制大鼠的MF（saline:159.2±10.0 gf,orexin:131.8±13.7gf,P<0.05;n=6）,阻断剂TCS对大鼠肌张力无显著影响（saline:159.2±10.0 gf,TCS:177.3±14.4 gf,n=6,P>0.05）。大鼠抓杆时间,orexin与TCS均无显著差异（saline:1.61±0.14s,orexin:1.49±0.14 s,P=0.179;saline:1.61±0.14 s,TCS:1.65±0.14 s,P=0.685）（n=6）。进一步发现orexin不引起睡眠/觉醒状态的转换,但可促进REM睡眠。与对照组REM睡眠总时长11.7±2.6%相比显著增加（3μM orexin-A:14.1±3.0%,P=0.319;30μM orexin-A:21.2±5.0%,P=0.0468）而阻断剂TCS可以抑制REM睡眠总时长减少到（9.4±2.5%,P=0.0304）（n=6）。统计REM持续时间(saline:36.9±5.6 s,3μM orexin-A:45.1±7.7 s,30μM orexin-A:56.5±8.3 s,TCS 3μM:29.8±5.2 s,Psaline vs 3μM orexin-A=0.175,Psaline vs 30μM orexin-A<0.05,Psaline vs TCS 3μM<0.01)（n=6）,我们发现,orexin-A可显著增加单次REM睡眠时长,阻断剂TCS则可以缩短REM睡眠时长。（2）长时程抑制下丘脑orexin-SLD神经通路诱发RBD肌张力控制障碍为进一步验证结果,我们通过化学遗传学方法长时程抑制下丘脑orexin-SLD神经通路。首先通过离体膜片钳验证CNO可以抑制表达h M4D的orexin神经元活动。EEG-EMG分析发现特异性抑制投射到SLD的orexin神经元,可降低EEG theta功率（溶剂组:409.3±52.3μV2,CNO:372.9±55.6μV2,n=8,P<0.05）但不影响其频率分布,对照病毒EEG theta功率无变化（溶剂组:340.9±113.3μV2,CNO:324.9±99.2μV2,n=5,P=0.518）。分析肌张力变化,发现NREM-REM肌张力下降幅度减弱（溶剂组:93.4±1.6%,CNO:99.0±1.5%,n=8,P<0.01）;对照病毒转换前后肌张力比值无变化（溶剂组:0.93±0.03,CNO:0.94±0.02,n=5,P=0.376）。提示下丘脑orexin-SLD神经通路抑制诱发类似RBD肌张力控制障碍综上所述,本课题证明了下丘脑存在orexin-PnC神经通路,并明确了其对肌张力调控的机制,效应以及功能意义,证明这一通路缺失可导致觉醒期猝倒。此外,我们也明确了REM期SLD调控肌张力的效应及机制,证实orexin缺失可诱发RBD肌张力控制障碍。这两条神经通路缺失导致的引发肌张力控制障碍与嗜睡-猝倒症发病有着密切关系,综上,我们的研究为临床诊断及治疗提供了新的理论依据。