干细胞指一类具有无限增殖能力和多向分化潜能的细胞。按其分化程度和分化能力，可分为胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞（IPSC）和成体干细胞（ASC）。ASC主要包括造血干细胞（HSCs）和间充质干细胞（MSCs）等。MSCs可来源于多种组织或器官，如骨髓、脂肪、胎盘、脐带和牙髓等。其中，骨髓间充质干细胞(BMSCs)因来源相对丰富，且取材方便，体外分离和培养方法成熟，因而研究最深入，临床应用最广泛。MSCs主要有四个方面的功能：支持HSCs重建造血、促进组织修复和再生、肿瘤的靶向治疗和免疫调节功能。其中，MSCs的免疫调节功能是目前研究的热点。MSCs为低免疫原性，生理状态下不能激活同种异体淋巴细胞反应。此外，MSCs还对多种免疫细胞，包括T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DC）和B淋巴细胞等具有免疫抑制作用。因此，MSCs在免疫性疾病的预防和治疗中有重要应用价值。尤其BMSCs用于治疗或预防骨髓造血干细胞移植（HSCT）产生的急慢性移植物抗宿主病（GVHD）的研究较多。尽管如此，关于MSCs的基础研究和临床试验还远远不足，许多问题尚未得到解答。目前存在的问题有：MSCs治疗免疫性疾病的机制，尤其对各种参与疾病的效应细胞的作用和机制；如何保证MSCs的临床应用效果；MSCs临床治疗的安全性等。CD8+T淋巴细胞及其激活后形成的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是参与移植物抗宿主病（GVHD）的主要效应性T淋巴细胞。由于MSCs在免疫性疾病的临床应用中，对GVHD的预防和治疗应用最多，效果也最明确，所以MSCs治疗GVHD的机制在MSCs对免疫性疾病的临床和实验研究中尤为重要，尤其MSCs对介导GVHD的主要效应性T淋巴细胞—CD8+T淋巴细胞的免疫调节作用和机制研究是其中的重要内容。目前国内外关于MSCs与CD8+T淋巴细胞相互作用的研究较少， MSCs调节CD8+T淋巴细胞功能的机制研究也很缺乏。为进一步探讨MSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节功能，阐明其作用机制，本论文从以下三个方面进行研究。第一部分：人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的：体外分离、培养和扩增BMSCs并进行MSCs鉴定，为后续实验提供充足的细胞来源。方法：通过Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，使用骨髓间充质干细胞培养基（BMSC-GM）进行体外培养和扩增；通过细胞定量接种和计数，制作细胞生长曲线；通过流式细胞术检测BMSCs的表面分子标记物；通过成骨和成脂诱导液体外培养考察BMSCs的多向分化能力；结合细胞形态、生长特性、表面分子标志物和多向分化能力等对所得细胞进行鉴定；比较各代细胞的特性。结果：体外培养的BMSCs呈纤维样，螺旋状生长；其生长曲线为“S”型，有典型潜伏期、生长期和平台期；表面分子标记物表现为CD29、CD105、CD166阳性，CD34、CD45阴性；BMSCs经体外诱导可分化为成骨细胞和脂肪细胞；结合细胞形态、生长特性、分子标志物和多向分化能力可鉴定所得细胞为MSC；P3-P6代BMSCs形态比较稳定一致，适用于后续实验。结论：通过体外分离、培养、扩增和鉴定，可获得足量的BMSCs，P3-P6代BMSCs适用于后续实验。第二部分：人骨髓间充质干细胞对CD8+T淋巴细胞的免疫调节功能研究目的：探讨BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节作用，并初步探讨MSCs作用于CD8+T淋巴细胞的有效浓度范围。方法：通过免疫磁珠技术，阴性选择法分离纯化人外周血CD8+T淋巴细胞，流式细胞术检测CD3+CD8+T淋巴细胞的比例；以BMSCs为刺激细胞，与同种异体CD8+T淋巴细胞进行共培养，羟基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）法检测CD8+T淋巴细胞的增殖；以植物血凝素A（PHA）为多克隆T淋巴细胞刺激剂，将CD8+T淋巴细胞与不同浓度BMSCs进行共培养，检测CD8+T淋巴细胞的增殖；将BMSCs与CD8+T淋巴细胞进行共培养，以PHA为刺激剂，实时荧光定量-聚合酶链反应（real time-PCR）法检测CD8+T淋巴细胞内白细胞介素2（IL-2）, γ干扰素（IFN-γ）和颗粒酶B（GZMB）mRNA的表达。结果：免疫磁珠法分选所得细胞中，CD3+CD8+T淋巴细胞占88.1%；当CD8/BMSCs为1:1-100:1时，与BMSCs共培养后，CD8+T淋巴细胞的增殖率无明显升高；当CD8/BMSCs为1:1-20:1时，BMSCs可抑制PHA刺激的CD8+T淋巴细胞增殖，且该作用表现为对BMSCs的浓度依赖性，BMSCs浓度越高，抑制作用越明显；当CD8/BMSCs为50:1-100:1时，BMSCs不能抑制CD8+T淋巴细胞的增殖；此外，BMSCs可抑制CD8+T淋巴细胞内IL-2、IFN-γ和GZMB的表达。结论：BMSCs具有低免疫原性，不能刺激同种异体CD8+T淋巴细胞的增殖；BMSCs在一定浓度范围内对CD8+T淋巴细胞具有免疫抑制作用。第三部分:人骨髓间充质干细胞对CD8+T淋巴细胞的免疫调节功能机制研究目的：阐明BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节机制，为临床应用奠定坚实基础。方法：建立transwell培养体系，避免BMSCs与CD8+T淋巴细胞的直接接触，检测CD8+T淋巴细胞的增殖；流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞表面的NKG2D受体表达和BMSCs表面的MICA/B配体表达；将不同浓度BMSCs与CD8+T淋巴细胞共培养，检测CD8+T淋巴细胞的NKG2D受体表达；使用MIC A/B单克隆抗体封闭BMSCs表面的MIC A/B分子，再将BMSCs与CD8+T淋巴细胞进行共培养，检测CD8+T淋巴细胞的增殖和IL-2、IFN-γ和GZMB的表达；通过real time-PCR法检测与CD8+T淋巴细胞共培养后BMSCs内吲哚胺2、3-双加氧酶（IDO）和肝细胞生长因子（HGF）mRNA的表达；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测前列腺素E2（PGE2）和转化生长因子β1（TGF-β1）在BMSCs与CD8+T淋巴细胞共培养体系上清液的含量；通过PGE2、IDO、TGF-β和HGF的阻断实验，检测分别或联合阻断PGE2、IDO、TGF-β和HGF后，BMSCs对CD8+T淋巴细胞增殖的抑制作用。结果：与直接接触的培养组比较，transwell培养组CD8+T淋巴细胞的增殖率升高，但未完全恢复；CD8+T淋巴细胞表达NKG2D受体，BMSCs表达MICA/B配体；当CD8/BMSCs为1:1-20:1时，BMSCs可抑制CD8+T淋巴细胞的NKG2D受体表达，且该作用表现为对BMSCs的浓度依赖性，BMSCs浓度越高，抑制作用越明显；当CD8/BMSCs为50:1-100:1时，BMSCs不能抑制CD8+T淋巴细胞的NKG2D表达；封闭BMSCs表面的MIC A/B配体后，共培养体系CD8+T淋巴细胞的增殖率和细胞因子表达量升高；共培养体系BMSCs的IDO表达增高，HGF表达无明显变化；共培养体系上清液PGE2和TGF-β1的含量增高；分别阻断PGE2、IDO和TGF-β后，CD8+T淋巴细胞的增殖率升高，而阻断HGF无明显改变；同时阻断PGE2、IDO和TGF-β后，CD8+T淋巴细胞的增殖率升高，但明显低于三者单独作用时的理论叠加水平。结论：BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫抑制作用需要细胞间的直接接触，并在一定程度上有可溶性因子参与；CD8+T淋巴细胞表达NKG2D受体，BMSCs表达MIC A/B配体；BMSCs可在一定浓度范围内以浓度依赖的形式下调CD8+T淋巴细胞表面的NKG2D受体，从而抑制CD8+T淋巴细胞的增殖；BMSCs表面的MIC A/B配体参与BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫抑制作用，NKG2D受体与MIC A/B配体的相互作用是BMSCs对CD8+T淋巴细胞免疫调节作用的机制之一；可溶性因子PGE2、IDO和TGF-β参与BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节功能，但三者间无协同作用。总而言之，本研究揭示了BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节功能及其机制。证明CD8+T淋巴细胞表面的NKG2D受体和BMSCs表面的MIC A/B配体与BMSCs对CD8+T淋巴细胞免疫抑制作用有关。提出BMSCs通过其表面的MIC A/B下调CD8+T淋巴细胞表面的NKG2D表达，从而抑制CD8+T淋巴细胞的增殖和功能。NKG2D和MICA/B的相互作用介导了两细胞间的直接接触，是BMSCs对CD8+T淋巴细胞免疫抑制作用的重要机制之一。此外，本研究证明PGE2、IDO和TGF-β参与BMSCs对CD8+T淋巴细胞的免疫调节作用。提出可溶性因子PGE2、IDO和TGF-β是BMSCs对CD8+T淋巴细胞免疫调节作用的机制之一，但三者的作用无叠加效应。本研究结果进一步丰富了BMSCs在免疫性疾病临床应用的分子机理研究，为BMSCs的临床应用奠定了坚实的基础，也为提高BMSCs在免疫性疾病的临床应用效果提供了新的思路和启迪，具有重要的理论价值。