采用组织块贴壁培养法,成功地构建了安格斯牛肾组织、丝羽乌骨鸡和白耳鸡鸡胚等三个畜禽品种成纤维细胞库。样本含量分别为20、59和57;细胞传代次数为3代;冻存管数分别为59支、157支和322支;每支冻存管中的细胞数量分别为5.88×10⁶个细胞/ml,3.0×10⁷个细胞/ml和1.7×10⁷个细胞/ml。根据ATCC的细胞库鉴定内容与评价标准,对上述三个畜禽品种的成纤维细胞库进行了生物学性状研究、鉴定和综合评价,所得结果如下: 1.三个畜禽品种的成纤维细胞形态均为典型成纤维状,梭形或不规则三角形;生长时的细胞呈放射状、火焰状或旋涡状走形。镜下观察,细胞生长健康,形态良好。 2.三个畜禽品种的成纤维细胞复苏后,其生长曲线均呈“S”型,细胞经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合细胞生长规律。冻存前存活率分别为95.8%,97.3%利96%;复苏后存活率分别为92.2%,91.4%和90.5%。复苏后细胞存活率有所下降,其主要原因是细胞在冷冻和复苏过程中遭受机械和化学作用所致。 3.三个畜禽品种成纤维细胞的细菌、真菌和支原体等微生物检测结果均呈阴性。 4.三个畜禽品种成纤维细胞的核型分析结果分别为2n=60,78±和78±,均保持二倍体性状,遗传性能稳定,可以作为物种鉴别的依据。 5.三个畜禽品种成纤维细胞的LDH和MDH同工酶酶谱,LDH同工酶分别为5条,4条和4条;MDH同工酶分别为5条,2条和2条。两种同工酶酶谱均具种属特异性,细胞遗传性能稳定,表明未发生物种间细胞的交叉污染和恶性转化,可作为物种与品种分类的主要依据之一。 6.EGFP-N₃和DsRed外源基因在三个畜禽品种成纤维细胞的表达率分别为:25.6%,41.5%和20%。对比试验表明:EGFP-N₃和DsRed外源基因表达率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。 7.三个畜禽品种成纤维细胞经醇类处理后使用PEG化学促融的方法,使畜禽品种间两两细胞融合。安格斯牛和丝羽乌骨鸡的细胞融合率为97.2%,安格斯牛自身细胞融合率为94.9%,丝羽乌骨鸡自身细胞融合率为92.4%。并从各个角度充分说明细胞发生融合。细胞融合技术在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育,绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。 8.三个畜禽品种成纤维细胞的凋亡检测,凋亡率分别为1.2%,1.5%利0.9%。检测结果显示,构建的细胞库中的凋亡细胞数量很少,说明所构建细胞库中保存的细胞达到优质细胞标准。本试验是所建细胞库生物学特性研究的延续,为以后的深入研究提供了技术支撑。 本试验所构建的安格斯牛、丝羽乌骨鸡和白耳鸡三个畜禽品种的成纤维细胞库均达到ATCC的细胞库鉴定与评价标准。开辟了畜禽遗传资源在细胞水平上的长久保存的新途径,同时也为生命科学和动物克隆等研究提供宝贵材料。