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目的：肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase，MLCK)在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用，具有激酶活性和非激酶活性。通常认为Ca2+和钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合后，激活MLCK，进而使肌球蛋白20kD轻链(myosinlightchains，MLC20)19位丝氨酸磷酸化，从而激活肌球蛋白(myosin)头部的ATP酶活性，使Mg2+-ATP分解，由此产生的磷酸基结合于横桥使其处于高自由能状态，启动横桥循环，使粗、细肌丝相互滑动，最终导致肌肉收缩。然而，目前对于[Ca2+]i降至静息水平后平滑肌仍维持一定程度的张力以及在无Ca2+/钙调蛋白存在时仍可观察到肌肉收缩的现象难以解释。本文目的在于探寻MLCK的非激酶活性区域，进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制。
方法：以本实验室已有的pGEX-F6.5为模板，采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6.5/D，在原核细胞进行表达。利用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定表达的MLCK在细胞中的分布。运用亲和层析技术分离与纯化删除前、后表达的MLCK(F6.5和F6.5/D)。应用EnzChek磷分析试剂盒及孔雀绿方法检测MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶(简称ATP酶)活性的影响，比较删除前后不同的MLCK片段对ATP酶活性的影响程度。
结果：实验结果显示构建的表达载体pGEX-F6.5/D可以在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE及Westernblotting显示表达的MLCK以可溶的形式存在。经GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一表达条带。应用EnzChek磷分析试剂盒测定不同浓度MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响。结果表明：删除前后的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶均有激活作用。F6.5/D与F6.5比较，对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的激活作用下降。F6.5对非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的动力学特征为：Vmax=7.492±0.178倍；Km=1.037±0.062μM(n=3)，F6.5/D对肌球蛋白ATP酶活性动力学特征为：Vmax=1.449±0.053倍；Km=0.287±0.043μM(n=3)。实验中以谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferase,GST)为对照，测定其对非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的影响，结果显示ATP酶活性不随GST浓度变化而改变。采用孔雀绿方法检测不同浓度F6.5、F6.5/D对非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的影响。结果显示随着F6.5浓度的增加，ATP酶活性也随之增加。表明该片段对肌球蛋白ATP酶有明显激活效应；而F6.5/D对ATP酶活性的激活效应低于前者。对照组GST则无激活效应。结果与EnzChek磷分析试剂盒方法一致。
结论：通过本实验得出如下结论：
(1)构建了MLCK删除载体(将丙氨酸1002-亮氨酸1019序列删除)；在大肠杆菌中表达并得到可溶性的GST融合蛋白；经亲和层析获得纯化的MLCK表达片段。
(2)应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响。结果显示两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用，而且随着MLCK浓度的增加，酶的活性也增加。比较删除前、后MLCK对酶活性的影响，MLCK删除后对酶的激活作用明显低于删除前。表明删除的丙氨酸1002-亮氨酸1019氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的部分。
上述研究为探寻MLCK非激酶的活性区域提供了实验依据，为进一步阐明平滑肌收缩机制提供了理论基础。