作为生殖细胞的人类精子,承担着将男性的遗传物质传递给下一代的重要任务.精子功能的正常与否,直接涉及受精过程的正常进行和子代个体的健康状况.既往的精子生物学研究主要集中在精子的形态、生化及运动能力等方面的观察,但这些指标在健康人群精子中的变异度较大,其与精子某些重要功能、表型的相关性并非总是密切相关.传统看法认为精子是一个终末细胞,已经关闭基因的转录与表达;但最近日益增多的研究资料,特别是芯片技术的广泛应用,发现成熟精子中存在有大量而复杂的mRNA群体,然而其确切的种类和丰度尚不明了.基于这种情况,本文采用能较好反映全基因组基因表达水平的SAGE方法,分析正常人成熟精子中基因表达谱的特点,以寻求建立健康人类成熟精子的分子生物学"正常解剖图谱"的理论依据. 目前生物医学的研究已经步入后基因组时代,从结构基因组学研究转入功能基因组学研究.后者应用高通量的实验分析方法并结合统计与计算机分析去研究基因的表达、调控与功能.这其中基因表达谱的研究占有重要地位.基因表达谱的研究方法在目前主要有两种,①基于核酸杂交原理之模拟式的基因芯片方法,②基于测序原理之数字式的SAGE方法.SAGE是一种高通量的基因表达检测方法,获得基因表达谱十分方便.虽然还不尽完善,但它仍然是目前获得特定组织的全部表达基因的最好方法之一. 第一部分工作,通过SAGE方法建立健康人成熟精子基因表达谱.遴选育有子女的健康男性志愿者11人,年龄27岁～43岁.禁欲5～7天后采取精液.上游法纯化精子.Trizol试剂提取RNA.将十个志愿者每人的单次精液总RNA合并,作为"群体"样本;把另外一个志愿者的5次单独的精液总RNA合并作为"个体"样本;进行群体和个体样本SAGE文库的构建.群体SAGE文库和个体SAGE文库共测序877和853个克隆,各产生2万余个SAGE标签.这两个SAGE文库已被美国NCBI的GEO DataSets数据库接受(Accession No.为GSE3587). SAGE标签在两个文库里的分布特点,一是随着标签丰度的增高,标签所占的比例减少,其所对应的基因匹配也少;二是标签和基因匹配的分布情况在两文库之间极为类似.丰度高(出现频率≥20)的SAGE标签,约占总标签数目的23﹪,形成约0.9﹪的基因匹配;与此相对的另一极端,最低丰度(出现频率只有1次)的SAGE标签,占总标签数目的36～38﹪,对应74～76﹪的基因匹配;中间丰度(出现频率2～19次)的SAGE标签,占总标签数目的38～40﹪,对应23～26﹪的基因. 为了对那些在文库中存在丰度较高、出现概率较大的标签基因做进一步分析,从群体库和个体库中分别选取出现4次及4次以上的标签所匹配的基因,分别获得682个和638个基因,两者重叠部分为564个基因,这些属于与精子生物学功能重点相关的基因.统计学检验表明这些重叠基因的标签丰度在两文库之间无显著性差异(P=0.05为界),提示这些基因的表达丰度在成熟精子中相对稳定.从表达丰度在前30位的基因特点分析:(1)丰度最高的前30位标签所对应的基因中,26个是已知基因,4个是未知基因. (2)这些基因在精子中的表达频率很高,达到2,100～27,700TPM.(3)丰度最高的表达基因是"树突细胞蛋白",是一个广泛表达的基因,编码一个做为HSV受体的II型细胞膜蛋白.其次是"精子发生相关蛋白7",只在睾丸表达,编码一个45个氨基酸的蛋白.(4)从它们的组织表达谱来看,有些基因仅在单一组织细胞中表达,有些基因则是在有限的几个组织中表达,其余的基因则属于广泛表达的基因,提示后者参与更为基础的细胞功能的维持.(5)这些基因的分子功能涉及核酸结合、酶学催化、信号转导和结构蛋白等诸项性质.用在线DAVID2.1软件对成熟精子的564个重叠基因的功能性聚类分析,在389个能聚类的基因中,得到25组功能性的基因,最突出的是一组核蛋白基因,占全部聚类分析基因的四分之一(96/389),主要参与DNA依赖的基因转录和翻译调节.另一大组基因则是84个核糖体亚单位相关基因.其它基因类别包括蛋白多肽溶解相关者(27个);蛋白激酶(24个);免疫相关者(22个、);蛋白转运和定位相关者(18个);翻译后修饰相关者(16个):线粒体电子传递相关者(10个);ATP合成传递相关者ATP(7个);ATPase活性相关者(9个);蛋白质向核内运输传递相关者(9个);RNA结合和.RNA加工相关者(9个);钙离子结合相关者(8个)等等.从成熟精子表达基因的染色体分布来看,上述基因在24条染色体上的分布是非均匀的,按百万碱基上的基因数目衡量,基因分布密度最高的是19号染色体,基因密度值1.14,密度最低的是Y染色体,基因密度值为0.02;当考察每条染色体上的基因绝对数目时发现,1号染色体的基因数目最多(103个),其次是19号染色体(70个),Y染色体最少(2个).另外,还发现54个重叠性标签没有基因匹配,属于未知的新基因. 第二部分工作,观察酒精对健康人成熟精子基因SAGE表达谱的影响.结果表明七天的饮酒(40﹪酒精度(v/v)市售白酒,总量1000ml)能诱发人类成熟精子基因表达谱的变化:共有62个SAGE标签类别的丰度发生改变(P=0.05为界),其中52个标签上调(上升0.3到8倍)、10个下调(下降0.4到0.9倍).选取其中10个标签的匹配基因进行实时荧光RT-PCR(qPCR)定量分析,所得表达变化的结果与SAGE结果平行,两者的回归曲线相关系数r=0.8563(P<0.01),提示SAGE方法能较可靠地反映精子mRNA的变化情况. 分析62个标签所匹配的基因情况表明,从其分子功能来看,酒精诱导的21个基因产物中,有15个具有结合功能的;11个具有有催化活性的;4个属于结构性蛋白质;3个具有转运功能;2个具有有信号转导功能;1个有转录调节活性.酒精抑制的3个基因产物中,1个具有氧化还原活性;1个属于mRNA拼接活性的;还有1个是结构蛋白.从它们参与的生物学过程方面看,酒精诱导的基因中,17个参与生理过程,8个参与细胞学过程,4个与生物过程的调节有关,2个与发育过程有关;在酒精能诱导上调的基因中,有些是与精子发生直接相关的,例如OAZ3和YBX2.这种现象,一方面提示酒精极有可能会引起精子的健康方面的问题,值得我们重视;另一方面提示,酒精对精子的影响,机理之一可能就是通过影响精子发生这一环节.引人瞩目的是有2个基因产物是与酒精代谢有关的,丙酮酸激酶和甘油醛.3.磷酸脱氢酶,两者都在饮酒后被诱导从0上调到5个拷贝,提示精子有可能在动员自己的代谢潜能,对抗所面临的酒精胁迫.另外,在酒精抑制的3个基因中,涉及乙醛代谢、mRNA加工和有性生殖过程,可能与酒精对生精过程的毒害作用相关. 综合以上两部分工作,得到以下初步结论:(一)在健康人类成熟精子的表达谱研究中首次引入了SAGE方法,建立了个体和小样本群体两个SAGE文库,获得标签20237个和21052个:(二)验证了人类成熟精子中存在组成复杂、数量庞大的mRNA群体,推测其可能与精子发生和成熟、精子染色体重新包装、父亲的基因组印记、甚至合子的发育分化等有关;(三)发现成熟精子的mRNA以相当稳定的丰度存在,提示精子指纹的建立不仅可基于精子的RNA种类,亦可基于RNA的丰度,.从而形成更精密的精子指纹,有利于与精子的不同表型相联系;(四)发现54个可能的新基因,有待克隆;(五)短期大量饮酒所摄入的酒精有可能能够引起成熟精子基因m、RNA的改变;(六)酒精对成熟精子的生理生化可能有负面的影响;(七)精子mRNA表达谱对酒精可能是敏感的,提示精子mRNA有可能作为对精子有毒害作用化学物质的一个监测工具(比如以芯片形式).