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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥耶兹氏病,是由猪疱疹病毒I型(Suid heipesvirus I,SuHV-I)亦称伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种烈性传染病。免疫接种经典PRV Bartha-K61弱毒疫苗是防控伪狂犬病的有效途径之一。然而,近年来在我国很多地区的伪狂犬病疫苗免疫猪群中接连爆发了新的伪狂犬病疫情。研究表明,目前流行的伪狂犬病病毒(PRV)为变异株,这些变异株属于PRV基因II型。传统的Bartha-K61疫苗不能针对当前流行的变异株提供完全的保护。因此,需要对当前流行的PRV变异株进行快速致弱以及对PRV进行有效的防控。成簇规律间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)RNA系统是一种广泛存在于细菌和古细菌中的由RNA介导的可遗传性的获得性免疫系统,这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源基因(如噬菌体质粒)的免疫功能。在II型CRISPR系统中CRISPR-Derived RNA(crRNA)通过碱基配对与Trans activating crRNA(tracrRNA)退火形成复合物,此复合物能特异性识别基因组序列,引导Cas9核酸内切酶在目的片段进行切割使DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)。而通过人工设计的这两种RNA,形成具有引导作用的sgRNA(Single guide RNA)。通过将表达sgRNA和cas9的原件相连,得到能够同时表达两者的质粒,转染细胞一定时间后进行病毒感染,可以实现cas9核酸内切酶对PRV的定点切割,从而构建基因敲除毒株。CRISPR-Cas9系统高效的基因组编辑功能已被应用于编辑较大的病毒基因组,包括艾滋病病毒I型(Human Immunodeficiency Virus I,HIV-I)、腺病毒(adenovirus,ADV)。本研究通过CRISPR/Cas9技术对PRV基因组进行快速编辑。为确定针对基因设计的sgRNA具有切割作用,通过病毒噬斑形成的多少对sgRNA进行筛选。将具有有效的sgRNA进行细胞转染后通过感染亲本病毒HeN1进行基因缺失毒株的筛选。通过基因测序及蛋白表达检测的方法进行基因缺失毒株的验证。本研究成功构建了1株gE基因缺失毒株gE-PRV。其在易感染动物小鼠体内的致病力与亲本毒株相比并无明显差异。在基因缺失毒株gE-PRV的基础上成功构建了gE/gI双基因缺失毒株gE-/gI-PRV,并在小鼠体内进行评估,结果表明gE-/gI-PRV基因缺失毒株与亲本毒株HeN1相比其致病力无明显差异。在基因缺失毒株gE-/gI-PRV基础上成功构建gE/gI/TK三基因缺失毒株gE-/gI-/TK-PRV,并在小鼠体内进行评估,结果表明gE-/gI-/TK-PRV基因缺失毒株与亲本毒株HeN1相比其致病力明显降低,同时gE-/gI-/TK-PRV毒株还可以诱导机体产生对亲本毒株PRV HeN1的免疫保护,其免疫力可达100%。本研究证明CRISPR-Cas9技术可以快速致弱PRV病毒,这对于当前PRV变异毒株的的防控至关重要。