子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期常见内科并发症——妊娠期高血压疾病中的一种类型,在产科较为常见,其诊断要点是孕妇于妊娠20周后首次出现收缩压≥140mm Hg和(或)舒张压≥90mm Hg,加上以下新发条件之一:蛋白尿(≥300mg/24h,或随机尿蛋白+),母体器官功能障碍(包括肾功能不全、肝脏损害、神经或血液系统并发症)及子宫胎盘功能不全(可能导致胎儿生长受限)。从全球来看,在低收入和中等收入的国家,每年有超过100万妇女死于妊娠相关疾病,大约10%的女性在妊娠期间患有高血压,其中并发子痫前期的占2%~8%。考虑到胎盘介于母体和胎儿之间,是维持胎儿宫内生长发育的重要器官,基于胎盘从母体娩出后PE临床症状能够较快缓解或可以自愈的事实,推测子痫前期的发病与胎盘的病理生理变化密切相关。大多学者认为胎盘的结构较为复杂,滋养细胞是其主要的细胞类型,而滋养细胞功能异常会导致对孕妇血管的侵袭障碍,即造成子宫螺旋动脉重塑不足,导致子宫胎盘血流灌注减少、胎盘缺血缺氧,进而释放一些细胞因子进入母体循环,损害孕妇血管内皮细胞。相关的发病学说还涉及遗传、营养、炎症及胰岛素抵抗等方面,但截止到目前,子痫前期的具体发病机制仍不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类长度为19~25个核苷酸非编码蛋白质的单链RNA,在基因转录后水平抑制信使RNA(m RNA)的表达或致其降解。自从研究者成功识别了3707个成熟的miRNAs之后,miRNA数据库得以建立,生物信息学分析表明人类超过30%的基因可能受miRNAs的调控,最近,越来越多的证据表明胎盘组织中异常表达的miRNAs与子痫前期的发病有关。趋化因子受体4(CXCR4)是趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1,又称CXCL12)的特异性受体,两者有较强的亲和力,通常形成SDF-1/CXCR4生物轴发挥生理学效应。有研究证实,SDF-1/CXCR4轴不仅影响免疫细胞的活化、迁移和募集,还参与血管生成、造血功能、胚胎发育以及肿瘤的侵袭和转移等多种进程。另外有学者在癌症相关的研究中发现CXCR4可能是miR-155的一个靶基因,miR-155通过调控CXCR4基因的表达,影响癌症的血管生成及癌细胞的功能,进而参与癌症的发生。但在子痫前期发病过程中,miR-155与CXCR4之间的表达及如何参与子痫前期的发病机制尚未见相关的研究报道。目的本研究旨在利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的实验方法,检测重度子痫前期组和正常对照组孕妇胎盘组织中miR-155和CXCR4 m RNA的表达水平,采用链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(即SABC法)免疫组织化学的实验方法、使用高通量检测工具——组织芯片对子痫前期组和正常对照组孕妇胎盘组织中CXCR4蛋白的定位及表达进行分析,初步探讨胎盘组织中miR-155和CXCR4的表达以及与子痫前期发病的关系。资料与方法1一般资料1.1 Real-time PCR研究对象选取2015年11月至2016年02月在河南省妇幼保健院产科住院,临床确诊为重度子痫前期、最终以剖宫产术分娩的30例孕妇的胎盘组织作为实验组(s PE组),同期因社会因素行剖宫产术分娩的30例健康孕妇的胎盘组织作为正常对照组(N组)用于检测m RNA的表达。1.2胎盘组织芯片研究对象同一课题组前期收集2007年12月12日至2010年12月31日在郑州大学第三附属医院住院,临床诊断为子痫前期、最终以剖宫产术分娩的80例孕妇的胎盘组织,同期因社会因素行剖宫产术分娩的58例健康孕妇的胎盘组织,由河南省妇幼健康转化医学工程实验室用于构建一种高通量检测工具——胎盘组织芯片,用来分析CXCR4蛋白的定位及表达。1.3研究对象诊断及纳入标准子痫前期及其不同分类的诊断标准严格按照人民卫生出版社出版的第八版《妇产科学》的诊断标准,整个孕期血压低于140/90 mm Hg,无尿蛋白出现,无母体内、外科及自身免疫性疾病等合并症,无其他产科并发症及胎儿异常情况等将纳入正常对照组。本实验中所纳入的全部研究对象均为单胎妊娠、剖宫产分娩。2方法采用实时荧光定量PCR技术从m RNA水平检测实验组和正常对照组孕妇胎盘组织中miR-155及CXCR4的表达情况;采用Spearman方法分析实验组孕妇胎盘组织中miR-155和CXCR4 m RNA表达的相关性;采用链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(即SABC法)免疫组织化学的实验方法从蛋白水平检测河南省妇幼健康转化医学工程实验室前期成功构建的胎盘绒毛滋养细胞(VCT)组织芯片(正常对照组42例,子痫前期56例)和绒毛外滋养细胞(EVCT)组织芯片(正常对照组29例,子痫前期47例)中CXCR4蛋白的表达及定位。3统计学方法实验过程中所得数据均采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料表示为均数±标准差((?)±s),使用2-△△Ct方法分析Real time-PCR实验结果。检验数据正态分布及方差齐性后,两者均符合者使用两独立样本t检验。相关分析采用Spearman相关分析法。免疫组化的实验结果为有序多分类的等级资料,使用秩和检验进行统计,以α=0.05为检验水准。结果1实验组和正常对照组孕妇临床特征的比较实验组(s PE组)孕妇年龄在22~35岁之间,平均为27.7±2.8岁,正常对照组(N组)孕妇年龄在20~32岁之间,平均为28.8±2.5岁。s PE组的分娩时体重指数(Body Msaa Index,BMI)、分娩孕周、收缩压、舒张压、平均动脉压、新生儿出生体重、尿蛋白分别为21.2±2.9 kg/m2、37.2±2.7周、169.5±17.6 mm Hg、112.4±15.7mm Hg、131.5±15.6 mm Hg、2210.6±905.1g、5.6±2.6 g/L。而正常对照组分别为22.2±2.4 kg/m2、38.7±0.8周、112.6±9.4 mm Hg、71.8±7.1mm Hg、85.6±7.5 mm Hg、3650.5±403.6g、0 g/L。在孕妇年龄、分娩时BMI及分娩孕周方面,两组相比差异无统计学意义(P>0.05);在收缩压、舒张压、平均动脉压及尿蛋白方面,实验组均显著高于正常对照组,在新生儿出生体重方面,实验组低于正常对照组,且差异均有统计学意义(P<0.05)。2 miR-155和CXCR4 m RNA在实验组和正常对照组孕妇胎盘组织中的表达miR-155、CXCR4 m RNA在实验组和正常对照组孕妇胎盘组织中的相对表达量依次分别为1.53±0.92、0.87±0.73;0.54±0.38、1.53±0.73,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3 miR-155和CXCR4 m RNA在实验组孕妇胎盘组织中表达的相关性miR-155在实验组孕妇胎盘组织中的相对表达量为1.53±0.92,CXCR4m RNA在实验组孕妇胎盘组织中的相对表达量为0.54±0.38,采用Spearman检验对实验组孕妇胎盘组织中miR-155及CXCR4 m RNA进行相关性分析,结果显示:二者呈显著负相关关系(r=﹣0.773,P<0.05)。4 CXCR4蛋白在胎盘VCT和EVCT组织芯片中的表达及定位CXCR4蛋白在胎盘滋养细胞和绒毛外滋养细胞的细胞膜和细胞质中均可见表达。通过对所有位点染色结果进行分析显示:胎盘VCT组织芯片中,CXCR4蛋白在子痫前期组的阳性表达率为48.21%(27/56),正常对照组的阳性表达率为83.33%(35/42),两组相比差异有统计学意义(U=715.5,P<0.05);胎盘EVCT组织芯片中:CXCR4蛋白在子痫前期组的阳性表达率为48.94%(23/47),正常对照组为79.31%(23/29),两组相比差异有统计学意义(U=362.0,P<0.05)。结论重度子痫前期患者胎盘组织中miR-155可能通过调控CXCR4的表达参与子痫前期的发病。