论文部分内容阅读
本论文以蛋白含量丰富的秋刀鱼为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽,利用体外化学模型和体内动物模型综合评价了秋刀鱼多肽的抗氧化活性,在此基础上利用动物模型评价其抗疲劳功效。然后采用多种分离技术对秋刀鱼多肽进行分离纯化,并采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)联用电喷雾质谱(ESI-MS/MS)对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定,最后研究了秋刀鱼多肽的在加工储藏过程中的抗氧化活性,并研究了抗疲劳肽功能性饮料的配方。秋刀鱼的蛋白含量为18.18%,鱼肉的氨基酸含量丰富,组成合理,富含必需氨基酸、呈味氨基酸、抗氧化活性氨基酸以及支链氨基酸等多种具有营养价值的氨基酸可用于蛋白酶解生产活性多肽。采用食品级风味蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰酶和木瓜蛋白酶水解秋刀鱼蛋白,以还原力为指标,确定了胰酶为秋刀鱼蛋白制备抗氧化肽的最适酶。在此基础上,分析了加酶量、水料比和酶解时间对胰酶酶解秋刀鱼的影响,并利用响应面对酶解条件进行优化,结果表明,蛋白回收率和氧化自由基吸收能力(ORAC值)达到最优的酶解条件为加酶量1085 U/g蛋白,水料比3:1,酶解时间8h,p H 8,酶解温度50°C,此时蛋白质利用率77.16%,ORAC值为877.92μmol Trolox/g。采用3种体外化学模型和小鼠实验综合评价秋刀鱼多肽的抗氧化活性。体外抗氧化活性结果表明秋刀鱼多肽的DPPH?清除能力是相同蛋白浓度的GSH的0.5倍;当PSPHs的蛋白浓度分别是GSH蛋白浓度的15倍、6倍时,两者O2-?清除能力和还原力相等。体内抗氧化活性结果表明PSPHs能使小鼠体内的抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活力比空白组分别提高4.97%-15.11%和20.89%-34.74%,而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)相对空白组却并无显著提高。综上可表明秋刀鱼多肽具有一定的体外和体内抗氧化活性。.与空白组相比,秋刀鱼多肽可延长小鼠的死亡游泳时间达8.67%-34.69%;能延缓或减少小鼠运动时机体中肝糖原的消耗,多肽组的小鼠肝糖原含量比空白组高1.09-1.17倍;秋刀鱼多肽能清除小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的积累,多肽组的小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的含量分别比空白组减少了8.60%-14.33%和6.79%-22.95%。秋刀鱼多肽能够显著降低大鼠血清肌酸激酶及乳酸脱氢酶活性,使小鼠血清中的肌酸激酶的活力比空白组降低了29.96%-36.24%,因此秋刀鱼多肽具有较好的抗疲劳功效。采用大孔吸附树脂、凝胶层析分离、RP-HPLC等系列技术对秋刀鱼多肽进行了分离纯化,所得两个目标肽段ORAC值比分离前提高了9.9倍和4.18倍,也比相同蛋白浓度的谷胱甘肽(GSH)活性强4.47和1.17倍,说明分离纯化可显著地富集抗氧化肽。最后用RP-HPLC联用ESI-MS/MS对功能肽段的氨基酸序列组成进行了鉴定,得到两个目标肽段的氨基酸序列为Ser-Gly-Ala-Ala-Met和His-Gly-Glu-Glu,分子量分别为435Da和470Da。秋刀鱼抗氧化肽的稳定性研究表明秋刀鱼多肽的耐热性和耐酸性较好;耐碱性较差;Cu2+和Zn2+浓度的增加能显著降低其抗氧化活性(P<0.05),而Mg2+、Ca2+和K+则对其影响不显著(P>0.05);冷冻和喷干燥方式对秋刀鱼多肽抗氧化活性的影响不存在显著差异(P>0.05);灭菌方式对秋刀鱼蛋白多肽的抗氧化稳定性的影响由大到小依次为:高压蒸气灭菌、沸水灭菌和巴氏灭菌;液态冷冻和固态真空包装方式保存蛋白多肽均可保持90%以上的抗氧化活性,其中固态真空包装比液态冷冻更有利于保持蛋白肽抗氧化活性。另外,研究出秋刀鱼蛋白肽功能性饮料的配方为:秋刀鱼蛋白肽稀释液、枸杞和蜜枣浸提液的用量均为40%(v/v),蓝莓香精液用量为0.2%(v/v),三氯蔗糖+蜂蜜混合液为0.7%(v/v),氯化钠约0.7%(g/v),以乳酸调节饮料p H至5.5,最后补水至所需体积。