论文部分内容阅读
拟盘多毛孢(Pestalotiopsis)普遍存在热带和亚热带地区,多数为弱致病真菌,可引致各类叶斑病,兼有对果实和采后农产品为害,部分种类腐生,部分种类是植物内生真菌的重要类群,尤其是很多木本植物重要内生真菌。植物内生拟盘多毛孢物种多样性比较丰富。本文利用从广西和浙江不同植物的茎叶中分离到的菌株、浙江农科院和贵州大学惠赠的拟盘多毛孢菌株开展了拟盘多毛孢属的分类学、分子系统学和DNA条形码研究,并以四个DNA片段为材料用分子系统学方法分析杨梅的病原拟盘多毛孢与内生拟盘多毛孢之间的关系。主要取得如下结果:1、根据形态特征与ITS和β-tub序列分析,将分离和收集的995株拟盘多毛孢菌鉴定为13个分类单元,分别为异色拟盘多毛孢(Pestalotiopsis versicolor)、广布拟盘多毛孢(P.dissmeninta)、小孢拟盘多毛孢(P.micospora)、欧克安拟盘多毛孢(P.oxyanthi)、韦司梅拟盘多毛孢(P.vismiae)、长毛拟盘多毛孢(P.longisetula)、棒形拟盘多毛孢(P.clavispora)、甘薯拟盘多毛孢(P.batatae)、马可罗拟盘多毛孢(P.macrochaeta)、疏毛拟盘多毛孢(P.pauciseta)、茶拟盘多毛孢(P.theae)、卡斯特尼拟盘多毛孢(P.karstenii)、杭州拟盘多毛孢(P.hangzhougensis)。2、对广西良凤江国家森林公园苏木科、木兰科和桃金娘科共16种植物的内生拟盘多毛孢多样性进行调查。结果显示,从苏木科Caesalpiniaceae、木兰科Magnoliaceae和桃金娘科Myrtaceae共16种植物中分离得到89株拟盘多毛孢,经形态学鉴定为11个种。在调查的植物中,桃金娘科中的白千层(Melaleuca leucadendra)、假多瓣蒲桃(Syzygiμm polypetaloideμm),苏木科的银珠(Peltophorμm tonkinense)、中国无忧花(Saraca chinensis)分离得到的拟盘多毛孢种数分别为8、6和8、6种,是拟盘多毛孢定殖种类最多的植物种类;银珠内生拟盘多毛孢定殖率最高,为2.86%。内生拟盘多毛孢在植物枝条的定殖率高于叶片,秋季高于其他的季节。经比较,三科植物内生拟盘多毛孢的多样性指数以苏木科最高(2.2353);桃金娘科次之(2.1635);木兰科最低(1.8637)。3、开展单基因和多基因系统发育分析,结果显示,单基因和多基因系统发育分析结果显示,EF1-α、β-tub+EF1-α 组合、ITS+β-tub+EF1-α 联合和ITS+β-tub+EF1-α+GPDH联合都能反映拟盘多毛孢属的系统演化关系。经过对比发现,β-tub和EF1-α联合构建系统发育树上主要进化分枝与形态特征的对应关系最好,该系统树根据进化分枝的演化关系,将拟盘多毛孢分成两个分支,反映拟盘多毛孢分生孢子有色胞的两种颜色类型即淡色(褐色至橄榄色)和暗色(暗褐色或煤烟色至褐色),亚分支反映分生孢子顶端附属丝末端匙状膨大与否、顶端附属丝数量以及分生孢子长度和宽度,基部附属丝的有无、是否分叉在系统发育树没有对应关系。4、在ITS、β-tub(Beta-微管蛋白基因)、EF1-α和GPDH等4个DNA片段中筛选拟盘多毛孢的条形码。综合两项指标即PCR和测序成功率,获得DNA片段的容易程度从高到低的排序为 ITS(100%)= EF1-α(100%)>β-tub(97.3%)>GPDH(81.1%)。用BioEdit软件对分子系统发育树的平均种内相似率和平均种间相似率进行计算,当平均种内相似率越大,而平均种间相似率越小,反映该序列建立的系统树更能体现对物种的识别。从平均种内相似率(简称AS)来看,β-tub(AS =0.994)>EF1-α(AS = 0.990)>GPDH(AS = 0.932)>ITS(AS = 0.877),而从平均种间相似率(简称ASi)来看,从高到低的排序为GPDH(ASi=0.957)>ITS(ASi=0.884)>EF1-α(ASi=0.860)>B-tub(ASi=0.781)。以 ITS+ββ-tub 序列组合的平均种内相似率(AS = 0.994)与ITS+EF1-α序列组合的平均种内相似率(AS=0.992)接近,且ITS+β-tub序列组合的平均种间相似率(ASi = 0.863)大于ITS+EF1-αα序列组合的平均种间相似率(ASi = 0.848)。以ITS+β-tub+EF1-α序列组合的平均种内相似率(AS = 0.994)与ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列组合的平均种内相似率(AS=0.993)接近,而ITS+β-tub+EF1-α序列组合的平均种间相似率(ASi = 0.768)小于以ITS+β-tub+EF1-α+GPDH 序列组合的平均种间相似率(ASi = 0.783)。β-tub、ITS+β-tub组合、ITS+EF1-α组合和ITS+β-tub+EF1-α组合的平均种内相似率(AS)和平均种间相似率(ASi)之间有一条相对比较清晰的分界线,适合作为分子条形码,而ITS、EF1-α和GPDH以及ITS+β-tub+EF1-α+GPDH序列组合的平均种内相似率和平均种间相似率之间重叠严重,不太适合作为分子条形码。根据以上计算结果,ITS能区分开的拟盘多毛孢物种有6个物种,不能区分开的拟盘多毛孢共计7种;β-tub能区分开的拟盘多毛孢物种有10个物种,不能区分开的拟盘多毛孢共计3种,EF1-α能区分开的拟盘多毛孢物种有9个物种,不能区分开的拟盘多毛孢有共计4种;GPDH能区分开的拟盘多毛孢物种有5个物种;不能区分开的拟盘多毛孢有7种,P.batatae尚缺数据;ITS、β-tub、EF1-α和GPDH等4个DNA片段对拟盘多毛孢物种识别率从高到低的顺序为 β-tub(76.9%)>EF1-α(69.2%)>ITS(46.2%)>GPDH(38.5%)。从ITS+β-tub和ITS+EF1-α序列组合可以看出,ITS+β-tub序列组合能区分开的拟盘多毛孢物种有11个物种;不能区分开的物种是P.longisetula和P.versicolor。ITS+EF1-α序列组合能区分开的拟盘多毛孢物种有9个物种;不能区分开的物种是P.longisetula、P.versicolor、P.oxyanthi和P.batatae。ITS+β-tub 和 ITS+EF1-α 序列组合能识别的拟盘多毛孢物种分别是11种和9种;ITS+β-tub+EF1-α序列组合和ITS+B-tub+EF1-α+GPDH序列组合对拟盘多毛孢物种识别率分别是100%和92.3%。根据PCR成功率、测序成功率、平均种内相似率、平均种间相似率以及各DNA片段及其组合对拟盘多毛孢的物种识别率综合分析,结合公用分子数据库(GenBank)中ITS序列数据丰富,而其他序列所涉及到的物种还很有限的现状,建议把ITS作为拟盘多毛孢属的主要条形码,β-tub作为拟盘多毛孢属的辅助条形码,对于个别比较难以鉴别的种类,可采取ITS+β-tub+EF1-α序列组合建立分子系统树对拟盘多毛孢属物种进行识别。5、用ITS、β-tub、EF1-α和GPDH等4个DNA片段分别构建系统进化树探讨杨梅病原拟盘多毛孢与杨梅内生拟盘多毛孢菌株之间的关系,结果显示,病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢,只要是同一个种,都会聚集在同一个分支上。结果还揭示同种拟盘多毛孢对寄主的器官一般没有专一性,如异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢可在杨梅的主干、枝条和叶片内生或致病,茶拟盘多毛孢仅在野生杨梅的枝条和叶片上内生。