多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一种髓鞘脱失为主的中枢神经系统（Central nervous syestem,CNS）炎性疾病,其主要病变为血-脑屏障受损、外周的T细胞和巨噬细胞浸润中枢,引发炎性反应破坏髓鞘并继发轴索变性。完整的髓鞘是CNS生理机能正常运行的重要前提,而脱髓鞘病变后髓鞘再生对机体预后至关重要。再髓鞘化,即髓鞘再生,包括少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）的动员和少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）的分化/成熟两个关键阶段,其受正、负因素的调节。脱髓鞘后产生的髓鞘碎片在加剧CNS炎症反应,诱发神经元的变性坏死及抑制髓鞘再生中发挥着重要的作用。因此,髓鞘碎片的清除就显得十分重要。作为CNS的固有免疫细胞,小胶质细胞在MS及其体内外模型中的研究主要集中在炎症状态下的极化,及其对OLs、星形胶质细胞（Astrocyte,AST）和神经元的影响。但较少有人研究小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬作用及吞噬发生后对髓鞘再生的影响。因此,寻找靶向小胶质细胞吞噬清除髓鞘碎片进而促进髓鞘再生等关键环节发挥作用的经济有效药物,对治疗CNS脱髓鞘疾病具有巨大的潜力。法舒地尔（Fasudil,FSD）作为血管扩张剂中的一员,对蛛网膜下腔出血导致的血管痉挛有较好的治疗效果。对脱髓鞘相关模型研究发现,Fasudil通过保护血管内皮,减少免疫细胞浸润,减轻CNS炎症,进而延缓髓鞘脱失并再生神经元突触。因此,在本研究中首先在细胞水平检验Fasudil对BV-2小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的影响;其次,通过体内实验探究Fasudil对双环己酮草酰二腙（Cuprizone,CPZ）模型小鼠的疗效,并通过体内外实验探讨Fasudil对小胶质细胞M1/M2型的影响及M1/M2型细胞与吞噬之间的关系;继之,通过体内外实验明确Fasudil促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的信号通路;最后,通过体内外实验探讨吞噬髓鞘碎片的小胶质细胞在髓鞘的保护以及再生中的作用。第一部分Fasudil对BV-2小胶质细胞吞噬功能的影响目的:观察Fasudil不同浓度和不同时间点对BV-2小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的影响。方法:小鼠BV-2小胶质细胞培养后,以合适的细胞密度进行实验,首先各组加入5mg/ml荧光髓鞘碎片（Fluorescein-labeled myelin debris,FMD）,将细胞与不同浓度的Fasudil（0μg/ml,7.5μg/ml,15μg/ml,30μg/ml和60μg/ml）共培养48h。BV-2细胞吞噬功能测定采用流式细胞术、荧光显微镜和多功能微孔读板机。进而,分别用15μg/ml的Fasudil和等量PBS对BV-2细胞干预不同时间（0h,6h,12h,24h,48h和72h）,用流式细胞术分析Fasudil干预不同时间点BV-2小胶质细胞对FMD的吞噬情况。结果:1.与0μg/ml干预组相比,BV-2小胶质细胞吞噬FMD的能力并非随着Fasudil浓度的增加呈逐渐增强的趋势。相对而言,15μg/ml的Fasudil干预情况下吞噬FMD的BV-2小胶质细胞数量最多,且吞噬FMD的能力最强。2.随着时间的延长,PBS对照组和Fasudil干预组BV-2小胶质细胞对FMD的吞噬能力逐渐增强。与PBS对照组相比,Fasudil干预能够明显增强BV-2小胶质细胞对FMD的吞噬。结论:Fasudil诱导BV-2小胶质细胞吞噬FMD具有浓度非依赖和时间依赖的特征。第二部分Fasudil通过诱导小胶质细胞向M2表型极化发挥抗炎和增强吞噬的作用目的:观察Fasudil对髓鞘碎片诱导的小胶质细胞极化的影响,并探究极化状态的小胶质细胞与髓鞘碎片吞噬的关系。方法:体内实验:将C57BL/6雄鼠分至三组:正常组,标准喂食6周;模型组,喂食0.2%CPZ饲料6周;Fasudil治疗组,喂食0.2%CPZ饲料6周,第5周开始每日40mg/kg的Fasudil腹腔注入。正常组和模型组注入等量0.9%Na Cl。隔日称量小鼠体重,于6周末应用Morris水迷宫（MWM）、高架十字迷宫（EPM）和强迫游泳实验（FST）来检测小鼠的认知、焦虑和抑郁样行为表现。小鼠脑切片行Fluoro Myelin染色观察各组小鼠脑内脱髓鞘情况。通过免疫荧光染色评估小胶质细胞i NOS和Arg-1的表达,用Western blot对脑组织内i NOS和Arg-1蛋白进行定量分析。体外实验:将培养的BV-2小胶质细胞分为四组:Fasudil组加入15μg/ml的Fasudil,PBS组加入同体积的PBS,Myelin+Fasudil组加入5 mg/ml的FMD和15μg/ml的Fasudil,Myelin+PBS组加入5 mg/ml的FMD和同体积的PBS,培养箱孵育48 h。一部分通过免疫细胞荧光和Western blot法分析i NOS和Arg-1的表达。另一部分通过流式细胞术分析Fasudil对FMD刺激的小胶质细胞M1型（CD16/32、iNOS和IL-12）及M2型（CD206、Arg-1和IL-10）的影响。进一步通过门控FMD-和FMD+细胞来分析M1型和M2型小胶质细胞吞噬FMD的情况。采用ELISA法检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量。结果:1.体内结果:（1）体重变化:各组小鼠0周称重无统计学差异（P>0.05）。实验过程中,正常组小鼠体重持续增加,6周末平均体重为28.85±0.67 g。与正常组（25.18±0.71 g）相比,模型组小鼠平均体重2周末明显下降（19.67±0.61 g,P<0.0001）,然后缓慢增加,在第6周末较0周有所增加（22.78±0.74 g）,但仍与正常组存在明显差异（P<0.0001）。与模型组比较,Fasudil治疗2周可改善CPZ小鼠体重下降（P=0.0027）。（2）行为学改变:MWM结果显示,与正常组相比,CPZ鼠逃避潜伏期和上台前路程出现延长（P<0.001,P<0.01）,目标象限活动时间占比下降（P<0.05）,而Fasudil能够逆转这些行为学的变化（P<0.05,P<0.01和P<0.05）。EPM结果显示,与正常组相比,CPZ鼠在闭合臂停留时间和活动距离均出现增加（P<0.01）,而Fasudil能缩短CPZ鼠在闭合臂停留时间和活动距离（P<0.05）。FST结果显示,与正常组比较,CPZ鼠游泳的平均速度和总距离均缩短（P<0.001,P<0.01）,游泳休息时间延长（P<0.0001）,而Fasudil既可延长CPZ小鼠游泳的平均速度和总时间（P<0.05和P<0.001）,又可缩短游泳休息时间（P<0.001）。（3）病理学检测:同正常组比较,CPZ小鼠胼胝体区髓鞘的脱失明显增加（P<0.001）,而Fasudil能明显抑制小鼠脑胼胝体区髓鞘的丢失（P<0.05）。（4）免疫荧光染色结果显示,模型组小鼠胼胝体区域Iba-1+i NOS+细胞数量显著高于正常组,而Fasudil可有效抑制Iba-1+i NOS+细胞的数量,并使胼胝体区域Iba-1+Arg-1+细胞数量明显增多。（5）Western blot显示,与正常组相比,CPZ鼠脑i NOS蛋白增多（P<0.01）,而Arg-1蛋白水平下降（P<0.05）。相反,Fasudil在抑制脑内i NOS蛋白表达的同时,升高Arg-1表达（P<0.05,P<0.001）。2.体外结果:（1）Western blot显示,与PBS组相比,FMD刺激BV-2小胶质细胞高表达i NOS蛋白（P<0.01）,而Fasudil抑制i NOS表达（P<0.01）的同时,升高Arg-1的表达（P<0.01）。（2）免疫细胞荧光染色显示,FMD诱导BV-2小胶质细胞i NOS表达增高,而Fasudil干预抑制i NOS并促进Arg-1的表达。（3）流式细胞术结果显示,同PBS组相比,FMD促使M1型小胶质细胞标志物CD16/32和i NOS的表达上调（均为P<0.0001）,而抑制M2型CD206和Arg-1的表达（P<0.05,P<0.01）。Fasudil干预抑制CD16/32和i NOS表达的同时（均为P<0.0001）,上调CD206和Arg-1表达（均为P<0.0001）。（4）ELISA法检测显示,与PBS组比较,FMD促使BV-2细胞产生TNF-α和IL-6（P<0.05,P<0.001）,而Fasudil干预可明显抑制这两种因子的产生（均为P<0.001）。同样,与Myelin+PBS组相比,Fasudil可促使FMD刺激后的BV-2细胞分泌IL-10和TGF-β（均为P<0.05）。（5）通过流式细胞术门控Myelin+Fasudil组FMD-和FMD+细胞发现,与FMD-细胞相比,FMD+细胞CD16/32、i NOS和IL-12的表达降低（P<0.001,P<0.0001,P<0.0001）,但CD206、Arg-1和IL-10的表达升高（P<0.001,P<0.01,P<0.0001）。结论:1.Fasudil改善CPZ脱髓鞘小鼠的体重变化和行为学异常;2.Fasudil既可促使体内外小胶质细胞向M2表型极化,又可促使M2表型细胞吞噬髓鞘碎片,进而改善CPZ小鼠脑内炎性微环境来保护髓鞘。第三部分Fasudil促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的机制研究目的:探讨Fasudil促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的相关分子机制。方法:体内实验:将C57BL/6雄鼠分至三组:正常组,标准喂食6周;模型组,喂食0.2%CPZ饲料6周;Fasudil治疗组,喂食0.2%CPZ饲料6周,第5周开始每日40mg/kg的Fasudil腹腔注入。正常组和模型组注入等量0.9%Na Cl。于6周末收集脑组织标本。应用免疫荧光染色观察小胶质细胞TREM2和DAP12的表达。Western blot检测脑内TREM2和DAP12蛋白的表达水平。体外实验:将培养的BV-2小胶质细胞分为四组:Fasudil组加入15μg/ml的Fasudil,PBS组加入同体积的PBS,Myelin+Fasudil组加入5 mg/ml的FMD和15μg/ml的Fasudil,Myelin+PBS组加入5 mg/ml的FMD和同体积的PBS,培养箱孵育48 h。应用RT-PCR、免疫细胞荧光和Western blot法分析BV-2细胞TREM2和DAP12的表达。随后,通过TREM2-Si RNA1-3转染BV-2小胶质细胞,RT-PCR分析选取最佳沉默效果的TREM2-Si RNA。进而,将BV-2细胞分为四组:Normal+FMD+Fasudil组加入5 mg/ml的FMD和15μg/ml的Fasudil,Normal+FMD组加入5 mg/ml的FMD和同体积的PBS,TREM2-Si RNA+FMD+Fasudil组使用TREM2-Si RNA沉默BV-2小胶质细胞TREM2后加入5 mg/ml的FMD和15μg/ml的Fasudil,TREM2-Si RNA+FMD组使用TREM2-Si RNA沉默BV-2小胶质细胞TREM2后加入5 mg/ml的FMD和同体积PBS。流式细胞术分析BV-2小胶质细胞对FMD的吞噬情况。结果:1.体内结果:免疫荧光染色结果显示,与正常和模型组相比,Fasudil促使CPZ小鼠胼胝体区域Iba-1+小胶质细胞高表达TREM2和DAP12。Western blot结果显示,与正常和模型组小鼠相比,Fasudil明显增加脑内TREM2和DAP12蛋白的表达（P<0.001,P<0.0001）。2.体外结果:（1）RT-PCR结果显示,与Myelin+PBS组相比,Myelin+Fasudil组BV-2小胶质细胞TREM2和DAP12 m RNA的相对表达增高（P<0.05,P<0.01）。进一步Western blot分析显示,Myelin+Fasudil组TREM2和DAP12蛋白表达较Myelin+PBS组明显增加（P<0.05,P<0.01）。同样,免疫细胞荧光染色结果显示,Myelin+Fasudil组BV-2小胶质细胞TREM2和DAP12的表达较Myelin+PBS组明显增强。（2）RT-PCR对沉默TREM2的BV-2细胞检测显示,TREM2-Si RNA1-3均使TREM2 m RNA的相对表达下降（P<0.0001,P<0.001,P<0.01）,尤以TREM2-Si RNA1抑制作用最强。（3）流式细胞术分析Fasudil对沉默TREM2的BV-2细胞吞噬能力的影响。结果显示,与Normal+FMD组相比,沉默TREM2的BV-2细胞对FMD的吞噬能力明显减弱（P<0.01）。Normal+FMD+Fasudil组相比,BV-2小胶质细胞TREM2的沉默可明显减弱Fasudil诱导的FMD吞噬（P<0.0001）。与TREM2-Si RNA1+FMD组相比,Fasudil也可增强沉默TREM2的BV-2小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬（P<0.05）。结论:Fasudil通过激活TREM2/DAP12通路促进内外源性小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬。第四部分Fasudil通过促进CPZ小鼠髓鞘碎片的吞噬和神经营养因子的表达影响髓鞘再生目的:观察CPZ脱髓鞘小鼠小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬,并探讨其对营养因子分泌和髓鞘再生的影响。方法:体内实验:将C57BL/6雄性小鼠分至三组:正常+髓鞘碎片组,标准喂食6周;模型+髓鞘碎片组:喂食0.2%CPZ饲料6周;模型+髓鞘碎片+法舒地尔组:喂食0.2%CPZ饲料6周,从第5周开始行脑立体定位注射FMD,并每日腹腔注入40mg/kg的Fasudil;正常+髓鞘碎片及模型+髓鞘碎片组于5周开始给予立体脑定位注射FMD,并腹腔注入等量0.9%Na Cl。于6周末收集脑组织标本。荧光显微镜观察胼胝体注射部位FMD的荧光强度。免疫荧光染色法检测非注射部位胼胝体区域小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的情况及该区域小胶质细胞BDNF和GDNF的表达情况。Western blot对脑内BDNF和GDNF蛋白表达进行定量分析。通过免疫荧光染色和Western blot测定脑组织Oligo2、PDGFRα和MBP蛋白的表达。体外实验:将培养的BV-2小胶质细胞分为四组:Fasudil组加入15μg/ml的Fasudil,PBS组加入同体积PBS,Myelin+Fasudil组加入5 mg/ml的FMD和15μg/ml的Fasudil,Myelin+PBS组加入5 mg/ml的FMD和同体积PBS,培养箱孵育48 h。RT-PCR分析细胞BDNF和GDNF m RNA的相对表达。免疫细胞荧光染色和Western blot测定细胞BDNF和GDNF的表达。ELISA法测定BV-2细胞上清液BDNF和GDNF的浓度。进一步用体外BV-2细胞条件培养液培养OPCs,免疫细胞荧光染色观察MBP的表达情况。结果:1.与正常+髓鞘碎片组相比,模型+髓鞘碎片组脑注射部位FMD的荧光强度增高（P<0.01）,Fasudil治疗后注射部位FMD的荧光强度明显降低（P<0.01）。免疫荧光染色结果显示,模型+髓鞘碎片+法舒地尔组髓鞘周围Iba-1+MBP+细胞增多。2.BDNF和GDNF荧光染色显示,与模型+髓鞘碎片组相比,Fasudil治疗能明显上调CPZ小鼠脑胼胝体区域Iba-1+小胶质细胞BDNF和GDNF的表达。Western blot证实,与正常+髓鞘碎片组相比,CPZ喂食的小鼠脑内BDNF表达下降（P<0.05）,而Fasudil治疗可促使BDNF和GDNF蛋白表达增高（P<0.01,P<0.001）。3.RT-PCR分析显示,与Myelin+PBS组相比,Myelin+Fasudil组BV-2小胶质细胞BDNF和GDNF的m RNA相对表达增高（P<0.001,P<0.0001）。同样,Western blot结果显示,Myelin+Fasudil组BDNF和GDNF的蛋白表达较Myelin+PBS组也明显增多（P<0.05,P<0.001）。此外,FMD还可抑制BV-2小胶质细胞GDNF m RNA和蛋白的表达（P<0.01,P<0.05）。免疫细胞荧光染色可见Fasudil促使BV-2细胞高表达BDNF和GDNF。进一步分析发现,与FMD-的小胶质细胞相比,大部分BDNF和GDNF的表达定位于FMD+的小胶质细胞（P<0.0001）。通过ELISA分析BV-2细胞吞噬后的上清液发现,Myelin+Fasudil组细胞上清液中BDNF和GDNF浓度较Myelin+PBS组明显增高（P<0.01,P<0.001）。4.免疫荧光染色显示,同模型+髓鞘碎片组小鼠比较,Fasudil不仅使胼胝体区域表达Oligo2和PDGFRα的OPCs增多,还可使胼胝体区域表达MBP的OLs增多。同样,Western blot结果显示,与模型+髓鞘碎片组小鼠相比,Fasudil可明显上调OPCs标记物蛋白（Oligo2、PDGFRα）和OLs标记物蛋白（MBP）的表达（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。5.免疫细胞荧光染色结果显示,与其他三组相比,Myelin+Fasudil组BV-2小胶质细胞条件培养液促使OPCs分支增多,并升高MBP的表达。结论:Fasudil在促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的过程中,促使其分泌神经营养因子,进而再生髓鞘。结论1.Fasudil以浓度非依赖和时间依赖的方式促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片。2.Fasudil可改善CPZ模型小鼠的临床症状,促使小胶质细胞由M1向M2表型极化,并增强M2型小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬能力。3.Fasudil通过激活TREM2/DAP12通路增强小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬。4.Fasudil通过增强吞噬髓鞘碎片的小胶质细胞分泌神经营养因子,促使OPCs的分化和成熟,进而再生髓鞘。