椎间盘退变是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基础，其结局往往是椎管狭窄、脊柱节段不稳、骨赘形成、腰腿痛、颈椎病、椎间盘突出及随之而来的神经根、脊髓受压等等，临床发病广，病情复杂。尽管目前广泛认为椎间盘变性是细胞学和生物化学共同作用的结果，但人们对椎间盘变性的机制并不清楚。细胞学和生物化学变化主要表现为细胞数量的减少和Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达产物的下降。随椎间盘变性发生细胞外基质合成下降，结果导致椎间盘疾病发生。近年随分子生物学发展，例如基因重组和基因克隆技术发展，可以得到大量的纯基因产物(RNA和蛋白质)应用于试验和临床工作。应用生物治疗合成蛋白多糖和Ⅱ型胶可原有效的延缓或逆转椎间盘变性的过程。 hBMP-2是骨形态蛋白家族中的一员，能促进细胞合成代谢。本研究是探讨不同浓度hBMP-2人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-hBMP-2)对体外培养人退变腰椎间盘细胞影响，为进一步hBMP-2基因治疗椎间盘退变奠定实验基础。 实验材料与方法： 1.腰椎间盘细胞分离培养 取成年人腰椎间盘突出症患者手术切除退变椎间盘18个。无菌分离椎间盘中髓核组织，用剪刀把髓核组织剪成1mm3组织块，组织块在0.2％胰酶和0.02％Ⅱ型胶原酶消化，细胞在37℃潮湿的含5％CO2孵箱中培养，每周更换细胞培养液2次。 2.Ⅱ型胶原表达 细胞爬片，采用过氧化物酶标记链霉卵白素进行免疫细胞学染色。3.aggrecan和Ⅱ型胶原表达 椎间盘细胞生长基本融合60％-70％，分别加入0ng/ml，10ng/ml和100ng/mlhBMP-2，在加入hBMP-2后第3d和第6d分别收集细胞培养上清液。采用ELISA法定量检测aggrecan和Ⅱ型胶原表达。 4.aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达 椎间盘细胞生长基本融合60％-70％，分别加入0ng/ml，10ng/ml和100ng/mlhBMP-2，在加入hBMP-2后第6d分别收集培养细胞，反转录聚合酶链反应检测aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达。 5.Ad-hBMP-2转染腰椎间盘细胞 待细胞生长至70～80％融合时，更换无血清培养基，根据同等条件下计数的细胞数加人Ad-hBMP-24h。含20％血清培养基继续培养，检测指标。 6.转染后椎间盘细胞鉴定 细胞爬片、转染，采用免疫细胞染色检测转染后Ⅱ型胶原表达。待细胞生长至70～80％融合时，根据同等条件下计数的细胞数加入Ad-hBMP-2(150MOI)4h。继续培养3d，基本融合前12h加入秋水仙素，收集细胞检测染色体数目。 7.X-gal免疫染色检测转染效率 细胞爬片，待细胞生长至70％～80％融合时，更换无血清培养基，根据同等条件下计数的细胞数加入Ad-Lacz(50MOI)4h，X-gal免疫染色检测转染效率。 8.转染后目的蛋白的表达 细胞转染后分别用免疫荧光和WesternBlot方法检测转染后细胞BMP-2的表达。 9.转染后aggrecan和Ⅱ型胶原表达 椎间盘细胞生长基本融合60％-70％，分别加入0MOI，50MOI，100MOI，150MOI的Ad-hBMP-2，在加入Ad-hBMP-2后第3d和第6d分别收集细胞培养上清液。ELISA法定量检测aggrecan和Ⅱ型胶原表达。 10.转染后aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达 椎间盘细胞生长基本融合60％-70％，分别加入0MOI，50MOI，100MOI，150MOI的Ad-hBMP-2，在加入Ad-hBMP-2后第6d分别收集培养细胞，反转录聚合酶链反应检测aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达。 11.统计学分析 所有数据均用均值±标准差((x)±s)表示。SPSS12.0软件进行one-wayANOVA分析，用q检验比较组间差异，以P＜0.05表示统计学差异显著。 实验结果： 1.腰椎间盘细胞鉴定 腰椎间盘细胞表现为多角型、星形，中央有圆形核，胞质内可见分泌颗粒。分泌Ⅱ型胶原是椎间盘细胞的功能，在第二代进行的免疫细胞学染色显示存在分泌Ⅱ型胶原功能。 2.ELISA检测aggrecan和Ⅱ型胶原表达结果 BMP-2组aggrecan和Ⅱ型胶原表达与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原的表达量逐渐增加。 3.aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的合成 BMP-2组(10ng/ml组和100ng/ml组)aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组，并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达量逐渐增加。 4.腰椎间盘细胞转染后形态变化 在第二代Ad-hBMP-2转染后细胞形态规则，转染细胞组生长旺盛。免疫细胞学染色显示存在分泌Ⅱ型胶原功能。染色体分析细胞的染色体数目23对，未出现多倍体及异倍体。 5.Ad-hBMP-2在腰椎间盘细胞内的表达 对照病毒Ad-LacZ转染后，细胞编码产生β-半乳糖苷酶，与底物X-gal反应生成蓝色，特异性染色结果显示：腰椎间盘细胞腺病毒转染效率接近100％。转染后细胞的hBMP-2免疫荧光显示对照组为阴性，阳性组从50MOI组到150MOI组荧光逐渐增强。Westernblot检测显示Ad-hBMP-2转染组有hBMP-2阳性条带，阳性组从50MOI组到150MOI组条带逐渐增强。未转染组和Ad-LacZ转染组150MOI呈阴性。 6.Ⅱ型胶原和aggrecan的合成 转染Ad-hBMP-2后第3d和第6d各组OD值显示转染组OD值高于对照组，并且随转染剂量增高，Ⅱ型胶原和aggrecan合成量逐渐增加。 7.aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达 转染Ad-hBMP-2后第6d，转染组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达高于对照组，并且随转染剂量增高，aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA表达量逐渐增加。 结论： 1.hBMP-2能促进Ⅱ型胶原和aggrecan合成，并且存在剂量依赖关系。 2.hBMP-2能促进Ⅱ型胶原和aggrecanmRNA合成，并且存在剂量依赖关系。 3.Ad-hBMP-2可以成功进入腰椎间盘细胞表达目的蛋白，并不影响细胞结构和功能。 4.Ad-hBMP-2转染腰椎间盘细胞，从50MOI组到150MOI组逐渐增加目的蛋白表达，并有良好的剂量关系。 5.转染Ad-hBMP-2后各转染组Ⅱ型胶原和aggrecan合成量高于对照组，并且随转染剂量增高。 6.转染Ad-hBMP-2后各转染组Ⅱ型胶原和aggrecanmRNA合成量高于对照组，并且随转染剂量增高。