背景和目的虽然肥胖以及代谢相关疾病一直是一个重要的健康话题,但脂肪组织和脂肪细胞已经被作为重点研究了很多年了。尽管在脂肪或脂肪组织中存在很多类型的细胞,但是在脂肪组织中脂肪细胞始终是主要的细胞类型,并且负责着一个重要的功能,那就是脂滴代谢。最近,成熟脂肪去分化的现象已经被很多物种的体外实验所发现。所谓的去分化现象就是成熟的脂肪细胞,在特定条件下逐渐失去脂滴,并最终成为成纤维样细胞也就是去分化脂肪细胞(DFAT)。有许多研究发现去分化脂肪细胞可以重新再分化成充满脂滴的脂肪细胞,或者在适合的条件下转分化成软骨细胞,成骨细胞,肌细胞或者其他可能的细胞类型。具有多能分化的去分化脂肪干细胞使这种细胞成为了新的干细胞研究方向,尤其是它相对来说更容易从潜在的病人身上分离提取。有报告指出再次移植去分化脂肪干细胞到体内可以再生新的脂肪垫、异位的骨组织或肌肉组织；去分化脂肪细胞可以促进括约肌的功能,参与梗塞的心肌组织的修复和中枢神经系统的修复。因此,去分化脂肪细胞可以是组织工程中很好的材料源,也是一些疾病中特定细胞的替代治疗。是近年来广受关注多能干细胞之一。去分化脂肪细胞的研究尚处在起步阶段,现有脂肪细胞去分化现象发生在天花板培养法中,因为培养时间长,不确定因素较多,可控性差等原因。一直制约着脂肪细胞去分化机制方面的研究。那么可否有其他方法可以引起脂肪去分化现象呢?染色质重组起因于核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化,这已经被证明是转录调节的重要组件。乙酰化和去乙酰化主要是通过组蛋白乙酰化酶(]SATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的平衡紧密调节的。抑制HDACs会引起乙酰化的组蛋白在细胞核内的聚集并且随后激活对目标基因的转录。并且已经被多次证明了用HDAC抑制剂如Apicidin,、曲古抑菌素A (TSA)、和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)上调了p21WAF1/Cip1,cyclin E的转录以及通过组蛋白超乙酰化来实现端粒酶反转录。因此HDAC抑制剂也作为一类抗癌的药物。然而,除了抗癌的作用外,最近的研究还显示HDAC抑制剂可以调节细胞的分化过程。这一点也是被分化过程中需要通过染色质重组来动态改变基因表达所支持了。的确,在脂肪细胞分化过程中,用丁酸钠(NaB)处理后回刺激成脂基因的表达。Apicidin [cyclo(N-O-methyl-l-tryptophanyl-l-iso-leucinyl-d-pipecolinyl-1-2-amino-8-oxodecanoyl)]作为一个真菌代谢物,已经被证明是一个抗原虫药,可以抑制寄生虫的组蛋白去乙酰酶(HDAC)。现在则更多的被用于抗癌药物的研究。而有报道显示Apicidin作为一种HDAC抑制剂可以影响脂肪的分化过程,并且去分化现象发生。这就给我们探索脂肪组织去分化新的启示。可否利用Apicidin引起的去分化现象来研究脂肪细胞去分化机制呢?Apicidin究竟是以何种方式影响脂肪的分化过程,到底能否使脂肪去分化,到底对那些成脂相关基因产生了改变?本实验仍以DFAT细胞为细胞模型进行一下几个方面的研究。1.从成熟的脂肪组织中利用消化酶法和天花板贴壁法获取DAFT细胞。2. Apicidin处理DFAT细胞观察其对脂肪细胞形态学的变化及脂滴定量的变化,并选定其诱导成脂的DFAT细胞去分化的安全有效浓度。3.在Apicidin作用成脂DFAT细胞前后分别测定已选取的在脂肪分化中部分的基因的转录表达及蛋白定量,分析其去分化的机制。研究方法1.去分化脂肪细胞的获取及鉴定将从南方医院整形科获取的脂肪组织用PBS清洗三遍,用剪刀剪碎成糊状,消化,用0.075%I型胶原酶37℃恒温摇床消化45min,期间需反复震荡混匀,等量体积的完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)中和后,200gM尼龙网过滤,滤过物200g/min离心5main,收集第二层脂肪细胞用200μM和150μM尼龙网过滤,以最大限度去除其它细胞的污染。鉴定：将脂肪细胞接种于培养皿中,用4%的多聚甲醛固定成熟脂肪10min,然后用PBS冲洗细胞后,先用1μg/ml尼罗红染色30分钟后再用10μg/ml的Hoechst33342染色30分钟。用荧光显微镜观察被染色细胞。尼罗红用598nm荧光滤镜观察,Hoechst33342用460nm荧光滤镜观察。2. DFAT细胞天花板贴壁培养法收集脂肪细胞接种于25cm2培养瓶中,平均每瓶0.5-1×105个细胞,瓶内充满完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗),将瓶翻转倒置于37℃,5%C02孵箱内,使漂浮的脂肪细胞接触培养瓶底。48h后,翻正培养瓶,小心吸出漂浮的脂肪细胞悬液,接种于新的25cm2培养瓶,进行新一轮天花板贴壁培养。第二个48h后,重复上一过程,以清除成纤维细胞状贴壁细胞。之后如果培养瓶内仍能观察到成纤维细胞状细胞存在,则将以上过程重复第三次。当镜下观察未见成纤维细胞状细胞污染时,吸出脂肪细胞悬液,接种于一倒置、密封、充满完全培养基的25cm2培养瓶内,放入孵箱培养10d让脂肪细胞贴壁牢固。10d后,翻正培养瓶,每2d更换完全培养基,每天镜下观察贴壁脂肪细胞的变化。冻存或传代至第5代进行后续的实验。3. Apicidin影响DFAT分化及去分化的形态学观察将P5代的DFAT细胞配成5×104/ml的细胞悬液,接种到96孔培养板。每孔200μl普通培养基。放入37℃,5%C02孵箱中培养。待细胞达到80～90%融合时。分别在成脂前和成脂后加入含有不同浓度的Apicidin的成脂诱导基或普通培养基来观察：1,Apicidin不同浓度对成脂后DFAT细胞的形态学的改变。2,在成脂诱导环境下Apicidin对成脂后DFAT细胞的形态学的改变。3,在成脂环境下Apicidin对DFAT细胞的形态学的改变。4,Apicidin处理后,对DFAT细胞成脂能力的形态学的改变。4.油红O染色检测不同浓度Apicidin对成脂后DFAT脂滴变化待细胞达到80-90%融合时,消化。将P5代的DFAT细胞配成5×104/ml的细胞悬液接种于2个六孔板(9孔)中,加入3m1/孔的完全培养基,放入37"C,5%C02孵箱中培养。成脂影响分化诱导步骤：待细胞达到80%-90%融合时,取9孔吸去旧培养液,加入3m1/孔的成脂诱导DMEM培养基(含10%胎牛血清,1%双抗、1μmol/L地塞米松,10μmol/L胰岛素,200μmol/L吲哚美辛,0.5mmol/L IBMX);留1孔做空白对照。每3d更换1次培养基,定向分化诱导第8天。取8孔诱导孔,分别换成含1、2、4、8、16、32、64、128μM/L Apicidin的普通培养基,留1孔诱导孔换普通培养基液继续维持做对照组。加入Apicidin的第3天,进行油红O染色和定量。每组做3个复孔。用酶标仪,波长490nm,测定OD值。5.MTT比色法测不同浓度Apicidin对DFAT的细胞活性的影响。将培养基、1xPBS和Trypsin-EDTA预先平衡至到室温。吸去培养液。用1xPBS洗涤细胞2-3次,以去除残留的血清。吸去PBS。加入适量Trypsin-EDTA,轻轻旋转,使Trypsin-EDTA均匀覆盖培养器皿表面,消化1-2分钟,显微镜下可见细胞间隙增大,细胞变圆,用手轻拍培养器皿的壁,立即加入2m1的完全培养基终止消化。用吸管吸取液体,轻轻吹打培养器皿表面,反复3-5次,使细胞彻底脱离瓶皿底壁,将细胞移入离心管中,再向培养瓶中加入1xPBS洗1-2次,并将洗液一并转移至离心管中。离心(244g,4分钟),吸去上清液。加入5m1的完全培养基重悬细胞沉淀,用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液,取样计数。取1块96孔板,每块板事先加含0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64gM/L9个浓度Apicidin的完全培养基,200μl/孔,每个浓度5个复孔,并设一个空白对照,每板50孔。取2×103cells/孔(96孔板)的密度接种至1块96孔板添加了培养基的孔中。培养至第3天,取一块板测MTT。6. RT-PCR检测部分基因表达变化情况检测PPARγ,C/EBPα,C/EBPγ,SREBP1C,GATA4、C-MYC、OCT4、 SOX2、TBX1、KLF4、NANOG、SOX17基因表达变化。待细胞达到100%融合时,B0组、B1组、B3组、A1组、A3组吸去旧培养液,加入2m1/孔的成脂诱导完全培养基开始诱导,空白组不做处理。成脂诱导完全培养基诱导7d,细胞出现较多较大的脂滴。诱导7d后,B0和空白组,直接送检QPCR。同时,B1组、B3组换成添加了1μmol/L Apicidin的普通培养基,每孔加2m1。而A1组、A3组换成普通培养基,每孔加2ml。B1组加药作用1d、A1组普通培养基培养1d,两组细胞送检PCR。B3组加药作用3d、A3组普通培养基培养3d,两组细胞送检PCR。7. Western-blotting检测部分蛋白水平的变化检测PPARy,C/EBPa,C/EBPβ,SREBP1C,GATA4、C-MYC、OCT4、 SOX2、TBX1、KLF4、NANOG、SOX17蛋白水平变化待细胞达到100%融合时,B0组、B1组、A1组组吸去旧培养液,加入成脂诱导完全培养基开始诱导。诱导7d后,B0提蛋白。同时,B1组换成添加了1μmol/L Apicidin的普通培养基,每孔加2m1。而A1组换成普通干培养基,每孔加2ml。B1组加药作用1d、A1组普通培养基培养1d,两组细胞提蛋白。结果1.去分化脂肪细胞的获取基培养新鲜分离的成熟脂肪细胞在装满培养基的培养瓶中漂浮起来,并因为浮力原因,紧贴在培养瓶上的天花板壁下。在培养的前2-3天,成熟脂肪细胞仍不能紧贴住培养瓶的天花板上。并且这些脂肪细胞内仍有着较大的脂滴并在光线下表现出高光线反射性,表现为透亮的黄颜色。并未发现有其他的细胞污染。通过尼罗红和Hoechst33342的染色示：成熟脂肪细胞内的脂滴被染成了红色,细胞核被染成了蓝色,并且常位于胞体的一侧,整个脂肪成戒环状。通过观察发现得到的游离的脂肪细胞纯度很高。这表明用这种方法分离的成熟脂肪细胞具有较高的纯度和活性。2. DFAT细胞天花板贴壁培养法大概从第4天左右开始成熟的脂肪细胞开始逐渐的贴紧天花板,并且已经有一些去分化的表现。但此时细胞贴壁仍并不十分牢固,晃动培养瓶时会使已贴壁的细胞脱落,故倒置培养的10天内,将瓶置于孵箱内较稳定,不受干扰或移动的位置为佳。观察发现并不是所有的脂肪全部可以去分化,还有一部分的脂肪细胞破裂并释放出游离的脂滴。去分化过程是首先脂肪细胞的一侧或两侧形成小的突出,并且细胞内单房的脂滴逐渐形成多间隔的小脂滴。最终细胞会形成梭形并且里面包含着许多小的脂滴。然后再需要一个很长的过程,梭形细胞内的小脂滴逐渐消失,并且细胞逐步变成成纤维样细胞。最后成纤维细胞开始克隆增殖。3. Apicidin影响DFAT分化及去分化的形态学观察1)在普通培养基培养环境下Apicidin不同浓度对成脂后的DFAT细胞的影响观察发现DFAT成脂后,加入Apicidin和普通培养基后。在不同浓度的Apicidin作用下,第3天虽然比第1天观察时脂滴仍在继续形成,但到了第5天观察,已经发现成脂得到了抑制并有着脂滴减少的现象,而这一现象与Apicidin的浓度不同而不同。2)在成脂诱导环境下Apicidin对成脂后的DFAT细胞的影响当加入Apicidin和成脂诱导培养基后,观察发现DFAT成脂后。在不同浓度的Apicidin作用下,第3天虽然比第1天观察时脂滴仍在继续形成,但到了第5天观察,已经发现成脂得到了抑制并有着脂滴减少的现象,而这一现象与Apicidin的浓度不同而不同。3)Apicidin对DFAT细胞的成脂发生影响随后将普通培养基替换含有Apicidin的成脂诱导基继续培养。于第3天和第5天发现,在含有不同浓度Apicidin的成脂诱导培养基的培养下,DFAT仍保持着成纤维细胞样的形态学特点。4) Apicidin处理后,对DFAT细胞成脂能力的影响普通培养基替换含有1μM/L Apicidin的普通培养基。3天后观察DFAT仍然保持着成纤维状的形态,未发现脂滴形成,后换成未含有Apicidin的成脂诱导液继续培养,成脂后第3天观察时细胞变形,胞浆内出现一些小而透明的脂滴并逐渐聚集,分化诱导后6天,DFAT细胞形态发生明显改变,从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变圆,并且开始出现较多脂滴的细胞。4.油红O染色加入Apicidin的第3天,镜下观察随Apicidin浓度的增加脂滴被破坏的程度逐渐加重,4、8μ.M/L是一个分界点,大于8μM/L的浓度下除了脂滴被破坏严重外,细胞的形态也被破坏,小于4μM/L的浓度下,细胞的形态有受影响但不严重,脂滴维持着良好的形态并有脂滴缩小的现象。通过油红O定量检测法测得1、2、4、8、16、32、64、128μM/L Apicidin处理成脂后和对照组的DFAT细胞三天后的油红O的OD为：0.16±0.00、0.16±±0.01、0.17±0.03、0.15±0.09、0.15±0.07、0.18±0.06、0.14±0.03、0.144±0.09、0.19±0.16。各组间测定细胞内脂滴含量的OD值之间存在显著性差异(F=8.627,P=0.000)。5.MTT比色法通过MTT比色法检测不同浓度Apicidin对DFAT的细胞活性的影响,0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64μM/L与空白对照比较得到的抑制率分别为0.33±0.10,0.38±0.09,0.444±0.09,0.53±0.07,0.61±0.08,0.68±0.05,0.66±0.08,0.67±0.06,0.674±0.07。各组之间存在显著性差异(F=14.232,P=0.000)。8、16、32、64μM/L四组组间多重比较无统计学意义。采用0.25、0.5、1、2、4、8μM/L与空白对照比较得到的抑制率进行线性回归测得Apicidin抑制50%DFAT细胞增殖浓度为1.475μM/L。6. RT-PCR与Western-blotting检测结果PPARy在成脂诱导之后诱导组(BO)相比未诱导组(A0组)基因高表达,在改用含有Apicidin的普通培养基(A1、A2组)和不含有Apicidin的普通培养基(B1、B2组)其表达量均有下降。下降的水平相当。蛋白水平也表现出水平下降的现象。C/EBPa的mRNA表达中成脂诱导后B0组高表达,A1与B1表达水平下降,B1下降的较明显。A2与B2水平继续下降。B2下降的较明显。蛋白水平与基因表达相符。C/EBPβ的mRNA表达显示,B0组有表达,但B1组表现出高表达,并且B2继续增高。但A1组低表达,但与B0组没有统计学差异,而A2组有升高表现。蛋白水平与基因表达相似。SREBP-1C的基因与蛋白遂平的趋势与C/EBPβ的趋势相近。同样也是基因表达A1与B1组没有统计学差异。NANOG的基因表达在A0组高表达,B0组有所下降,而A1与B1组都有所下降,并且A1组下降的更明显,A1与A2组均有所下降。蛋白水平与基因相符。TBX1中基因表达B0组高表达,B1表达与B0没有统计学差异,A1组有所下降,A2与B2组均继续下降。蛋白水平与基因表达相似。SOX17基因表达中A0与B0组均表达,但并没有统计学差异。B1表达明显升高,但A1表达下降。A2与B2表达均下降。蛋白水平与基因表达相似。GATA4的基因表达中B0有表达,B1表达升高,A1表达降低。A2与A1比较没有统计学差异,B2表达降低。蛋白水平与基因表达相似。OCT4的基因表达中,A0与B0组高表达但只见并无统计学差异。A1与B1组表达下降,A1组下降明显。A2与B2均继续下降。蛋白水平与基因表达相似。KLF4基因表达中,B0较A0表达降低,A1比B0略有降低,但B1比B0升高明显。A3与B3均有升高。蛋白水平与基因表达相似。C-MYC基因表达中B0表达增高,B1表达增高,B2表达继续增高,而A1表达下降,A2表达继续下降。蛋白水平与基因表达相符。SOX2基因表达中A0与B0高表达,A1与B1均降低,A1降低明显。A2与B2降低更明显。结论1、成熟脂肪细胞通过消化离心等方式处理可以获得较高纯度的游离的成熟脂肪细胞,通过天花板培养可以得到去分化脂肪细胞。并且可以经受传代和冻存等处理过程,可以作为可靠的脂肪细胞模型进行相关研究。2、Apicidin可以抑制DFAT的成脂过程,并且可以引起已经成脂的DFAT细胞的去分化现象。并且这一现象是可逆的。3、通过线性回归分析来确定Apicidin对DFAT细胞的半数抑制率为1.475μM/L,结合脂滴定量观察选1μM/L为最佳浓度。4、Apicidin启动脂肪去分化的同时也改变了脂肪细胞内干细胞标志性基因的变化。本实验提示Apicidin很可能是通过C-MYC的表达变化从而影响WNT通路改变脂肪分化的改变,来间接引起脂肪的去分化表现。本实验首次通过天花板培养法诱导脂肪去分化以外的方法进行了脂肪细胞去分化分子机制的研究。并研究众多干细胞相关基因及成脂关键基因的变化特点。首次提出了成熟脂肪去分化现象可能是通过C-MYC的表达变化从而影响WNT通路改变脂肪分化的改变,来间接引起脂肪的去分化表现。为之后更加深入的研究脂肪去分化机制打下了基础。