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本研究采用细胞培养、RNA干扰、GFP-LC3荧光标记、MDC染色、细胞计数、台盼蓝染色、MTS细胞活性检测和Western blot分析等细胞生物学和分子生物学技术和方法,以Raji细胞和小鼠原代B淋巴细胞为实验对象,通过建立的hsBAFF诱导细胞模型,探究了二甲双胍通过AMPK-mTOR通路经ULK1/Beclin1阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化分子机理。结果如下:1二甲双胍抵抗hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化Raji细胞和小鼠原代B淋巴细胞用不同浓度的二甲双胍(0.5-2 m M)预处理2 h后用hsBAFF(2.5μg/ml)刺激12 h或48 h。MDC荧光染色和GFP-LC3荧光评估B细胞自噬体数量的变化,Western blot分析相关蛋白表达,细胞计数、MTS分析和台盼蓝染色评估细胞增殖和活性。结果显示:二甲双胍以浓度依赖的方式逆转hsBAFF诱导B细胞自噬体数量下降,抑制hsBAFF诱导的B细胞p-ULK1(Ser757)和Bcl-2表达升高,并抵抗hsBAFF抑制的B细胞p-Beclin 1(Ser14)、p-Beclin 1(Thr119)及LC3-Ⅱ表达;同时二甲双胍也浓度依赖地抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和活性。提示:二甲双胍抵抗hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化。2二甲双胍调控ULK1/Beclin 1阻滞hsBAFF促进的B细胞活化感染慢病毒sh RNA ULK1、Beclin 1(Ser14D)或Beclin 1(Thr119E)突变体的Raji细胞,用二甲双胍(1.5 m M)预处理2 h后经hsBAFF处理12 h或48 h。Western blot分析相关蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光分析自噬体表现,细胞计数和MTS分析评估细胞增殖和活性。结果显示:下调ULK1导致基础的和二甲双胍诱导的p-Beclin 1(Ser14)和LC3-Ⅱ表达及自噬体数量显著降低,而Bcl-2及细胞增殖和活性呈相反变化,从而强化hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化;点突变Beclin 1(T119E)或Beclin 1(S14D)过表达显著提高基础的和二甲双胍诱导的LC3-Ⅱ表达及自噬体数量,同时降低细胞Bcl-2表达及细胞增殖和活性,进而抵抗hsBAFF抑制自噬促进的B细胞增殖和活性。提示:二甲双胍调控ULK1/Beclin 1阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化。3二甲双胍调控AMPK/mTOR通路经ULK1/Beclin 1信号转导阻滞hsBAFF促进B细胞活化Raji细胞和小鼠原代B淋巴细胞、或感染腺病毒Ad-AMPKɑ-ca、Ad-dn-AMPKɑ或Ad-GFP的Raji细胞,用二甲双胍(1.5 m M)预处理2 h后用hsBAFF(2.5μg/ml)刺激12 h或48 h,或用雷帕霉素(100 ng/ml)、Compound C(20μM)或AICAR(2 m M)预处理2 h接着二甲双胍(1.5 m M)预处理2 h后用hsBAFF(2.5μg/ml)刺激12 h或48 h。Western blot分析相关蛋白表达,细胞计数和MTS分析评估细胞增殖和活性。结果显示:二甲双胍抑制hsBAFF诱导B细胞AMPK活性下降;雷帕霉素强化二甲双胍抑制mTOR通路阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞增殖和活性;由AICAR激活AMPK或持续激活AMPKɑ(AMPKɑ-ca)过表达增强二甲双胍阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞增殖和活性,而用Compound C抑制AMPK或钝化AMPKɑ(dn-AMPKɑ)表达抵抗二甲双胍阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞增殖和活性。提示:二甲双胍调控AMPK/mTOR通路经ULK1/Beclin 1信号转导阻滞hsBAFF抑制自噬促进的B细胞活化。