目的:射干为较常用中药,具有清热解毒、消痰利咽之功效。前期项目组研究中,明确了药材抗炎主要活性组分为鸢尾黄素、野鸢尾黄素等;止咳主要活性组分为次野鸢尾黄素和白射干素。通过国内主要产地药材调查,发现不同产地之间射干药材上述组分含量差异较大,湖南湘射干甚至不含有主要止咳成分白射干素,造成临床应用效果参差不齐。本专题在前期研究基础上,采用薄层、HPLC等分析技术,对收集的7个产地22批射干药材进行化学成分对比研究,预期找到区分不同产地射干的鉴别方法;同时利用实验研究获得的数据,明确适合抗炎或止咳射干药材的主要产地,为药材临床应用提供科学依据。方法:1研究用药材的选择依据古典医籍、现代文献、网络信息、市场调研及前期项目研究情况,经查阅分析后,选择了本专题实验研究用药材。2基于化学成分薄层色谱对比研究射干抗炎、抗病毒、止咳、抑菌的主要成分为黄酮类化合物,前期项目组在薄层鉴别中,以射干对照药材为对照,对不同产地药材进行鉴别,结果由于黄酮类化合物含量大,薄层展开后黄酮斑点颜色较深,影响其他斑点观察,不适用于不同产地药材对比研究。故本专题研究依据现代文献报道射干含有化学成分,以GAP基地射干药材为对照,依次通过石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇提取乙醇浸出浓缩液,得到不同极性射干药材供试液;以展开后薄层斑点多少及清晰程度为评价标准,对展开系统（石油醚-乙酸乙酯、三氯甲烷-乙酸乙酯、三氯甲烷-甲醇等）、薄层材料(硅胶G、硅胶GF₂₅₄、聚酰胺等)、显色剂（10%硫酸乙醇试液、三氯化铝乙醇试液、香草醛硫酸试液等）等进行了考察,分别建立了药材不同极性供试液的薄层鉴别方法。通过7产地22批次射干不同极性供试液薄层斑点的数目及Rf值的对比,对比不同产地药材的化学成分。3基于化学成分的HPLC指纹图谱对比研究现代研究表明,射干药材含有萜类、甾类、挥发油及黄酮类化合物,由于黄酮类化合物含量较多,色谱峰在相应波长左右响应值大,封顶,将非黄酮类化合物色谱峰掩盖或压低。因此本专项研究将按药材所含化学成分性质,利用化学提取法,将药材提取液分成非黄酮类未知成分供试液和黄酮类化合物供试液进行指纹图谱研究。非黄酮类未知成分供试液指纹图谱研究中,采用HPLC法,利用DAD检测器,以色谱峰数目及分离度为考察指标,对检测波长（210nm、280nm、310nm）、流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水系统）、柱温（25℃、30℃、40℃）、色谱柱品牌（C18色谱柱,包括DIKMA、phenomenex、大连依利特等生产）等进行考察,确定了最佳色谱条件;以确定的共有峰峰面积为考察指标,通过精密度、重复性、稳定性等方法学考察,最后建立了射干药材非黄酮类未知成分HPLC指纹图谱分析方法,利用药典委员会提供的相似度评价软件及聚类分析方法对不同产地药材的非黄酮类未知成分进行对比研究。黄酮类化合物供试液指纹图谱研究中,以黄酮类化合物色谱峰数目及分离度为考察指标,对流动相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水-0.55%甲基-β-环糊精-0.1%磷酸水溶液等系统）、柱温（25℃、35℃、40℃）、色谱柱品牌（C18色谱柱,包括DIKMA、phenomenex、大连依利特等生产）等进行考察,确定了最佳色谱条件;以确定的黄酮共有峰峰面积为考察指标,通过精密度、重复性、稳定性等方法学考察,最后建立了黄酮类化合物HPLC指纹图谱分析方法,利用药典委员会提供的相似度评价软件及聚类分析方法对不同产地药材的黄酮类化合物化学成分进行对比研究。4基于活性成分含量的对比研究项目组前期研究结果表明,射干中抗炎止咳活性成分主要为鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B、野鸢尾黄素等化合物;止咳活性成分为次野鸢尾黄素、白射干素。本专题基于黄酮类化合物指纹图谱研究基础上,以止咳活性成分次野鸢尾黄素、白射干素,抗炎活性成分鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素及它们体内转化物射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷为对照品,以乙腈-0.1%磷酸水-0.55%甲基-β-环糊精-0.1%磷酸水溶液为流动相,265nm为检测波长,通过线性范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收率等方法学考察,确定了可以同时对射干苷等10个抗炎止咳活性成分单体进行测定的含量测定方法。通过不同成分含量结果聚类分析及数理统计,对不同产地射干的活性成分进行对比研究。5不同产地射干抗炎、止咳有效成分含量的对比研究现代文献及项目组前期研究结果,本专题在建立-基于活性成分含量测定研究的基础上,利用已建立的射干抗炎、止咳活性成分单体的含量测定方法,通过比对抗炎、止咳异黄酮类化合物含量,结合统计分析,确定适合于抗炎和止咳作用的射干药材产地。结果:1药材的选择结果查阅相关文献及国家科技部数据库,九.五、十.五国家科技计划将射干GAP基地建设委托与湖北中医药大学刘和刚教授,经过与刘和刚教授交流基地建设情况,决定选择湖北黄冈市团风县六颗枫树村郭美元老师种植的射干药材作为研究用对照药材。依据古典医籍,射干产地首载于陶弘景的《名医别录》,名曰:“生南阳田野”,后世本草均以此言作为产地描述,因此查阅相关种植文献,选择南阳市桐柏县大别山尾段的射干种植基地产品作为药材。依据国内射干药材销售及种植现状,目前国内主要集散地分布在河北安国和湖南,分别为祁射干和湘射干,占国内市场70%销售份额,尤其是河北安国,具有成套的栽培技术,因此选择河北安国及湖南产地栽培射干作为研究用药材。依据国内现代文献报道及网络信息,以南阳为中心点,筛选附近几个省-安徽、贵州、四川等所栽培的射干作为研究用药材。综上,本次实验选择了河南、河北、湖北、湖南、安徽、贵州、四川共7个省,22批次射干药材作为研究对象。2基于化学成分薄层色谱对比研究结果对射干石油醚提取小极性提取物薄层鉴别化学成分对比研究表明:通过不同展开系统对提取物展开条件进行选择（石油醚-乙酸乙酯系统、石油醚-丙酮系统、石油醚-丙酮与环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯二次展开系统）,不同显色剂显色（香草醛-浓硫酸试液、10%硫酸乙醇试液）,结果表明:22批次药材采用石油醚（60℃-90℃）-丙酮（2﹕1）展开4cm,再以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（14﹕5﹕3）展开8cm,10%硫酸乙醇试液显色,能够获得良好的分析效果。22批次射干药材,同等剂量下展开、显色,河北产6批次样品分别有2⁶个斑点;河南产2批次样品有4⁵个斑点;湖北产5批次样品有5⁷个斑点;湖南产3批次样品有4⁵个;安徽产3批次样品有5⁶个斑点;四川产2批次样品有5⁷个斑点;贵州产样品有7个斑点。虽然不同产地射干在斑点数目及颜色深浅具有差异性,但是同一产地射干之间也有较大差异,分析认为可能是由于成分之间转化或采集时间差异造成。对射干乙酸乙酯提取中极性提取物薄层鉴别化学成分对比研究表明:通过不同展开系统对提取物展开条件进行选择（石油醚-乙酸乙酯系统、三氯甲烷-乙酸乙酯系统、三氯甲烷-甲醇系统等）,不同显色剂显色（三氯化铝乙醇试液、10%硫酸乙醇试液、2%三氯化铁试液）,结果表明:采用三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（16﹕4﹕0.2）展开,利用三氯化铝乙醇试液显色,紫外下观察,能够获得良好的分析效果,斑点清晰度良好。22批次射干药材,同等剂量下薄层展开、显色后,斑点比较有明显不同,可以分成三类。第一类Rf值0.4处无黄白色荧光斑点,为湖南产射干;第二类为Rf值0.4处有黄白色荧光斑点,Rf值0.9处无蓝白色斑点,为河北、河南射干;第三类为Rf值0.4处有黄白色荧光斑点,Rf值0.9处有蓝白色荧光斑点,为湖北、安徽、贵州射干。所建立的方法可以快速、准确的将不同产地射干进行区分。对射干水饱和正丁醇提取大极性提取物薄层鉴别化学成分对比研究表明:通过不同展开系统（三氯甲烷-乙酸乙酯系统、三氯甲烷-甲醇系统、三氯甲烷-丁酮-甲醇系统）展开,不同显色剂显色（三氯化铝乙醇试液、10%硫酸乙醇试液、2%三氯化铁试液）,日光或紫外光等下观察。结果表明:聚酰胺薄膜,采用三氯甲烷-丁酮-甲醇（10﹕3﹕3）展开,三氯化铝乙醇试液显色,紫外下观察,样品供试液能够获得良好的分析效果,斑点清晰度良好。22批次射干药材,河北产5批次样品,河南产2批次样品,四川产2批次样品,贵州产1批次样品,湖北产4批次样品,安徽产2批次样品均有4个斑点;湖北、安徽各1批次,湖南3批次有3个斑点,虽然不同产地射干斑点数具有一定差异性,但是代表性不强。3基于化学成分的HPLC指纹图谱比研究结果非黄酮未知成分指纹图谱对比研究中,通过对流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸）,检测波长（210nm、280nm、310nm）,柱温（25℃、30℃、40℃）,色谱柱品牌（phenomenex、DIKMA、大连依利特）,供试液制备方法（柱层析法、石油醚超声法、石油醚索氏提取法）进行考察。结果表明:采用Agilent1100高效液相色谱仪;色谱柱:Diammonsil C18（2）5μm 250×4.6mm（DIKMA）;DAD检测器;流动相:A:0.1%磷酸水溶液,B:乙腈;流速:1.0mL·min^-1;检测波长:210nm;柱温:40℃,梯度洗脱,能够获得良好的分析效果,液相色谱图峰数目多且分离度良好。通过精密度、重现性、稳定性实验等方法学考察,建立了非黄酮类化合物HPLC指纹图谱分析方法;利用药典委员会提供的相似度评价软件及聚类分析方法对不同产地药材的化学成分进行对比研究。结果表明:22批射干可以分成两类:0.9¹.0之间与0.8⁰.9之间,其中,湖北射干除去6^#,河北的21^#与湖南的11^#相似度在0.8⁰.9;河北、河南、湖南、安徽、贵州、四川射干相似度在0.9¹.0。但是聚类分析结果无法将不同产地射干进行很好的区别。对11个共有峰峰面积进行研究发现,1号、2号、3号的共有峰峰面积,湖北射干、河北1批次与湖南1批次射干呈等差趋势依次下降,提示下一步可以利用该趋势,扩大样品进行进一步比对研究。黄酮类化合物化学成分指纹图谱对比研究中,通过对流动相（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸-0.55%甲基-β-环糊精）、柱温（25℃、40℃）、色谱柱品牌（phenomenex、DIKMA、大连依利特）进行考察,结果表明,得到的最佳色谱条件为:Agilent1100高效液相色谱仪;色谱柱:大连依利特SinoChrom ODS-BP 5μm 250×4.6mm;流动相:A:0.1%磷酸水溶液;B:乙腈;C:0.55%甲基-β-环糊精-0.1%磷酸水溶液;流速:1.0 mL·min^-1;检测波长:265nm;柱温:40℃,梯度洗脱,射干80%乙醇超声提取30min的样品供试液能够获得良好的分析效果,指纹图谱色谱峰数目多,分离度均良好。通过精密度、重现性、稳定性实验等方法学考察,建立了黄酮类化合物HPLC指纹图谱分析方法,利用药典委员会提供的相似度评价软件及聚类分析方法对不同产地药材进行对比研究。评价结果表明:22批次射干药材可以分成三类,相似度分别在0.95¹.0、0.85⁰.95、0.75⁰.85之间。其中湖北射干除去6^#,相似度均0.95¹.0,相似度较高且稳定;河北产射干、河南产射干、湖南产射干、贵州产射干相似度在0.85⁰.95;安徽产射干与四川产射干,相似度为0.75⁰.85之间。对12个共有峰峰面积进行聚类分析,可以将湖南射干聚为一类,湖北射干聚为一类。湖北射干共有峰峰面积,1号峰面积（>5000）约为其他产地的两倍以上,而12号峰面积（约为10）远远小于其他产地射干。4基于活性成分含量对比研究结果在黄酮类化合物指纹图谱研究基础上,以药材抗炎、止咳活性成分或转化产物:射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、白射干素为对照品,通过线性范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收率等实验考察,结果表明:指纹图谱色谱条件可应用于上述成分含量测定。对获得22批次样品含量测定结果进行比对、统计分析:以总苷（射干苷+鸢尾甲苷A+鸢尾甲苷B+野鸢尾苷）与总苷元（鸢尾黄素+鸢尾甲黄素B+鸢尾甲黄素A+野鸢尾黄素+次野鸢尾黄素+白射干素）含量分析表明:利用总苷与总苷元的含量,进行聚类分析,可以将湖南产射干单独聚为一类,其中湖南射干总苷含量远远高于其他产地射干,且含量比例总苷约占90%,苷元约占10%。而其他产地射干总苷的含量比例约为50%⁸0%,故可以聚为一类。以苷类成分（射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷）含量分析表明:利用4个苷类成分的含量,通过聚类分析,可以将湖南样品单独聚为一类;湖北样品与河北1批次样品聚为一类。其中,湖南射干的射干苷含量远远高于其他产地射干,含量比例（80%）也高于其他产地（25%⁴0%）,故可以聚为一类;湖北射干与1批次河北射干的射干苷含量较高,其含量比例（60%）低于湖南,但是比其他产地高,故也可以聚为一类。以相互转化化合物（射干苷+鸢尾黄素,野鸢尾苷+野鸢尾黄素+白射干素+次野鸢尾黄素,鸢尾甲苷A+鸢尾甲黄素A,鸢尾甲苷B+鸢尾甲黄素B）含量聚类分析,结果表明:湖南样品可单独分为一类;湖北射干与河北1批次样品分为一类。其中,湖南射干的射干苷与鸢尾黄素含量加和值远远高于其他产地,且含量比例,湖南射干为75%,约为其他产地的三倍（20%²5%）,所以可以聚为一类。湖北射干与河北1批次射干的射干苷与鸢尾黄素的含量比湖南射干低,但是高于其他产地射干,加和值比例约为40%,故也可以聚为一类。5不同产地射干抗炎、止咳有效成分含量对比研究结果本部分利用已建立的射干抗炎、止咳活性成分单体的含量测定方法,对22批射干抗炎、止咳异黄酮类化合物含量进行研究。研究结果表明,不同产地射干的抗炎、止咳有效成分含量差异较大,湖南射干与湖北射干的的抗炎有效成分含量最高,分别为40.80⁷3.34 mg·g^-1,27.71³7.94 mg·g^-1,分别以湖南、湖北含量均值为检验值,对7个产地射干抗炎有效成分含量进行T检验,结果显示P<0.05,湖南、湖北射干抗炎有效成分含量显著大于其他产地。止咳有效成分含量,安徽射干与湖北射干最高,分别为2.090².405 mg·g^-1,1.572².674 mg·g^-1,湖南射干最低,为0.822¹.262 mg·g^-1,且绝大部分为次野鸢尾黄素,高活性成分白射干素含量极微,分别以安徽、湖北、湖南含量均值为检验值,对7个产地射干止咳有效成分含量进行T检验,结果显示P<0.05,安徽、湖北射干止咳有效成分含量显著大于其他产地,湖南射干止咳有效成分含量显著小于其他产地。。结论:1在基于化学成分薄层色谱对比研究中,采用所建立的乙酸乙酯提取获得的中极性提取物薄层鉴别方法,可以将湖南产射干药材与其他产地药材区别。而湖南射干为所有药材中止咳活性组分含量最低的药材产地,因此可以在临床应用中通过此方法明确射干药材能否治疗与感染咳嗽相关疾病。2在非黄酮类未知成分HPLC指纹图谱对比研究中,采用所建立的方法,通过不同产地药材色谱峰峰面积的不同,利用相似度评价结合共有峰峰面积特征,可以将湖北产射干及湖南射干与其他产地射干进行区别。利用此方法,结合薄层鉴别,可以将湖南与湖北产射干区分。3在黄酮类化合物化学成分HPLC指纹图谱对比研究中,采用所建立的方法,通过不同产地药材色谱峰峰面积的对比,结合聚类分析,利用相似度评价结合共有峰峰面积特征,可以分别将湖南产射干、湖北产射干与其他产地射干进行区别,为湖北GAP基地优质药材临床应用提供给了技术支持。4 HPLC含量测定对比研究中,采用黄酮类化合物指纹图谱的方法,可以利用不同产地射干10种异黄酮类化合物含量为标准,结合聚类分析,建立了湖南产射干、湖北产射干分别与其他产地射干进行区别方法。5不同产地药材抗炎、止咳含量测定结果结合统计分析表明:7省22批次射干药材,湖北射干与湖南射干的抗炎成分含量最高,为治疗感染性疾病的首选;湖北与安徽产药材的止咳成分含量最高,为治疗感染性咳嗽疾病的首选,且二者来源不远,均在大别山中段地区。6本专题为国家十三.五重大新药创制课题的辅助项目,目的是确定创新中药新药研究中使用药材的专属性鉴别,通过上述研究,基本能够将优质射干中药材鉴别方法初步确定。由于样品采集范围、批次及时间限制,方法可能存在一定的缺陷,有待进一步补充。