全程自养脱氮，即Deammonification，是一种新型的污水脱氮工艺。它是指在同一反应器中，在限氧和较高pH值条件下，完全由自养菌群作用将氨氮转化为氮气而除去的现象。它于90年代后期被发现，主要存在于生物转盘、生物滤池和生物流化床等生物膜系统中。近几年来，国外的许多研究机构开始了对全程自养脱氮系统中的微生物群落组成和结构的研究。本研究也是污水脱氮领域的前沿课题之一。 本论文建立了全程自养脱氮的完全混合活性污泥反应器和悬浮填料反应器2个系统，以市政污水处理厂二沉池活性污泥进行接种，通过3个月至半年的驯化，并精确控制反应条件，在实验室成功富集了具有较高全程自养脱氮效率的污泥微生物样本。这是首次对连续运行的活性污泥反应器中的全程自养脱氮现象进行研究。 在此基础上，本论文综合使用多种分子生物学手段，主要是16SrRNA同源性分析方法、分子克隆文库构建和荧光原位杂交(FISH)技术，分析全程自养脱氮系统中的微生物群落组成，对参与全程自养脱氮的关键细菌进行系统发育分析，观察全混污泥和悬浮填料2个反应器在不同操作条件和不同处理效果时的菌群动态变化，揭示系统中微生物群落的空间结构和相互作用关系，探索以分子手段对反应器运行进行动态实时监测的可行性，全面阐述全程自养脱氮反应的微生物学机制，并基于双层膜结构理论，提出了关于全混合活性污泥模式不可持续的原因的假说。 本论文建立的全混合活性污泥反应器，从驯化开始大约80天后，总氮去除率可达62﹪，系统的容积去除率达到85mgN/(Ld)，然而，在大约100天后，系统的脱氮效率明显下降，直至最终脱氮效果几乎全面丧失。批式试验证明：80天时的污泥生物相可以在限制溶氧条件下，将NH4+-N氧化成NO2--N，同时又可催化NH4+-N和NO2--N反应生成N2，整个脱氮过程不需外加有机碳源，符合全程自养脱氮的全部条件。而悬浮填料反应器在经过4-5周的试运行完成挂膜后，总氮去除率为70﹪±5﹪，容积去除效率为95±12mgN/(Ld)，在近300天的实验期内，该反应器均保持相当好的脱氮效果。 为了摸索出最有效的DNA提取方法，本文分别采用酶法、化学法、珠磨匀浆法和反复冻融法对活性污泥样品进行破壁，提取总DNA，并通过提取的核酸总量、纯度、片段分布情况、是否含有PCR反应酶抑制剂、以及ITS扩增产物多态性共5个指标来评价不同的细胞破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响。结果表明：化学法的优势最明显，结果最稳定。提取的总量最多，片段长度也大，但是杂质含量也较大，纯度较低，不过这些杂质并不影响PCR反应。ITS扩增产物长度多态性分析也证明化学法的偏倚性最小。因此，本文在以后的研究中采用化学法提取总DNA。 本文在全混污泥反应器和悬浮填料反应器运行的不同阶段取样，使用真细菌通用引物926f和1545r对污泥总DNA进行PCR扩增，克隆文库的分析结果显示：在活性污泥系统逐步恶化的过程中，其中的菌群结构也发生了巨大变化，类浮霉状菌属细菌Planctomycetes从占据优势到完全消失，而氨氧化菌克隆从只占文库的2.4﹪上升到占70﹪。这一过程还伴随着大量异养细菌的消亡。在悬浮填料系统中，类Planctomycete细菌、Nitrosomonas属氨氧化菌、和另外一些功能未知的、能在贫营养条件下生存的紫细菌构成了其中稳定的生物相。这一结果表明：类浮霉状菌属Planctomycete细菌是全程自养脱氮过程的关键种群，它的消失是反应器脱氮效率降低的直接原因。类Planctomycete细菌和Nitrosomonas属氨氧化菌是全程自养脱氮生物相中最重要的2个成员。本实验室的全混污泥反应器和悬浮填料反应器中的类Planctomycete菌克隆彼此亲缘关系较近，但与已知的Anammox细菌CandidatusBrocadiaanammoxidans和CandidatusKueneniaStuttgartiensis的亲缘关系较远。这说明：能够完成自养脱氮的浮霉状菌在种的水平上可能是很丰富的。本文还发现反应器运行不同阶段的氨氧化菌都属于Nitrosomonas属，但其中的优势种并不相同。 为了了解不同目标基因对氨氧化菌种群分析结果的影响，理解多种手段的重复交叉验证对于科学实验的重要意义，本文针对3类目标基因，16SrDNA上的氨氧化菌特异的CTO片段、氨单加氧酶活性基因amoA片段和16S-23SrRNA基因间隔序列ITS片段，建立克隆文库或通过电泳分离，考察不同污泥样品中的氨氧化菌组成和种群内变迁。结果表明：随着驯化的进行，Nitrosospira属细菌和Nitrosomonasoligotropha细菌逐渐被能够耐受高氨氮低溶氧的Nitrosomonaseuropaea细菌所代替。而氨氧化菌的种群变迁可能并不是全混流系统全程自养脱氮效率下降的原因。在方法学方面，本文发现：基于CTO片段和氨单加氧酶活性基因amoA片段的研究结果吻合良好。 FISH试验表明：在全程自养脱氮反应器中，存在一种在可见光下呈红色的菌落。这一菌落能够与类Planctomycete细菌的16SrRNA探针杂交。在活性污泥系统中，杂交区域位于一个大菌落中心，被大量异养细菌紧密包围。氨氧化菌探针的杂交实验显示：氨氧化菌点缀于菌群中，没有聚集生长的趋势。这一结果充分肯定了在全混污泥系统中，异养细菌的作用——维持共生体结构的稳定性，为关键细菌类Planctomycete创造良好的生长代谢环境——无氧的自养的微生境。而生物膜系统能够较长时间的稳定运行，是由于有微生物共生体所需要支持性载体存在。 本文还以全程自养脱氮类浮霉状菌的特征序列、ITS扩增片段长度多态性和随机引物扩增多态性为分子标记，进行了反应器分子监测的试验。考察市政污水处理厂活性污泥、全程自养脱氮反应器污泥中的优势菌群演变情况，以及污泥生物多样性变化情况。以类浮霉状菌的特征序列为基础设计的引物在市政污水处理厂污泥和反应器污泥中都扩增出目标条带。扩增产物的克隆文库表明：这对引物能够扩增出2种类浮霉状细菌，其中一种经驯化筛选后，成为反应器中的优势菌群。这意味着全程自养脱氮反应很可能是浮霉状菌属中的一些菌种在特定条件下形成的一种特殊的代谢途经。 本文进行了以ITS扩增多态性和随机引物扩增多态性为标记的监测方法的初步实验。结果表明：ITS更适合种及亚种水平的细菌分类；根据其序列设计的探针可以监测某种微生物在不同环境不同条件下的活性；而RAPD分析更适合于微生物群落的横向比较。 本论文的研究成果有利于在未来设计合理的单级脱氮反应器，有利于实验室研究向工业化放大，实现脱氮过程的低成本、高效能。